高中生物-BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度課件

測(cè)定蛋白質(zhì)濃度BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度BCA法學(xué)習(xí)掌握BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的基本原理?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)原理】

BCA(bicinchoninicacid，二辛可酸)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理與Lowery法相似，即在堿性條件下蛋白質(zhì)與二價(jià)銅離子Cu2+絡(luò)合，并將其還原成一價(jià)銅離子Cu1+。一價(jià)銅離子和BCA試劑反應(yīng),使其由原來的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm有強(qiáng)烈的光吸收，且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此可用于蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。BCA測(cè)定蛋白質(zhì)的范圍是20μg/ml~200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5μg/ml~10μg/ml。【實(shí)驗(yàn)原理】

BCA(bicinchoninicacid，F(xiàn)olin-酚試劑法(Lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。Folin-酚試劑法(Lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)在【實(shí)驗(yàn)器材與試劑】

1．器材（1）儀器：分光光度計(jì)；恒溫水浴箱；槍式移液管。（2）玻璃儀器：試管13支，吸管2ml1支、O.1ml3支?！緦?shí)驗(yàn)器材與試劑】

1．器材高中生物-BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度課件高中生物-BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度課件高中生物-BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度課件2．試劑（1）試劑A：1％BCA二鈉鹽2％無水碳酸鈉0.16%酒石酸鈉0.4％氫氧化鈉0.95％碳酸氫鈉混合，調(diào)pH值至11.25。（2）試劑B：40g/L硫酸銅。（3）BCA工作液：試劑A100ml＋試劑B2ml，混合即成。市面有BCA法試劑盒銷售

4）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：用結(jié)晶牛血清白蛋白，根據(jù)其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（5）待測(cè)樣品。2．試劑（1）試劑A：1％BCA二鈉鹽【實(shí)驗(yàn)步驟】1．取試管13支，編號(hào)（除空白管只做1管外，其它各號(hào)測(cè)定管均重復(fù)做兩管），按下表操作并記錄：

BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量管號(hào)試劑(μl)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管×21×22×23×24×25×2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1.5mg/ml)—20406080100—雙蒸水10080604020——待測(cè)樣品——————100BCA工作液(ml)2.02.02.02.02.02.02.0混勻，37℃保溫30min，比色測(cè)定光吸收值(λ=562nm)【實(shí)驗(yàn)步驟】1．取試管13支，編號(hào)（除空白管只做1管外，其它2．以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3．用測(cè)定管平均光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算求出該待測(cè)血清蛋白質(zhì)的含量(g/L)。4．從標(biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光吸收值相接近者，按比色法計(jì)算公式計(jì)算求出該待測(cè)血清的蛋白質(zhì)濃度(g/L)。2．以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?！舅伎碱}】試比較BCA法與雙縮脲法、Lowery法的異同。為什么BCA法常常用于科研？其有哪些優(yōu)勢(shì)？【思考題】【實(shí)驗(yàn)原理】分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵(-CONH-)的化合物，在堿性溶液中能與硫酸銅中Cu2+反應(yīng)生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵，具有雙縮脲反應(yīng)，且在一定范圍內(nèi)紫紅色顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可以用光吸收法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)原理】雙縮脲法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量此方法被科研工作者廣泛選用，其特點(diǎn)：1.操作簡便，快速，比經(jīng)典的Lowry法快4倍；2.靈敏度高，最小檢測(cè)量達(dá)0.5μg；3.準(zhǔn)確，試劑穩(wěn)定性好，在20μg/ml~2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法；4.經(jīng)濟(jì)實(shí)用，測(cè)定可在微板孔中進(jìn)行（待測(cè)樣品體積為1μl-20μl），可大大節(jié)約樣品和試劑用量；5.抗干擾能力較強(qiáng)，不受絕大部分樣品中的去污劑、尿素等化學(xué)物質(zhì)影響。此方法被科研工作者廣泛選用，其特點(diǎn)：高中生物-BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度課件方法基本原理靈敏度（mg/ml）干擾程度和主要干擾物蛋白質(zhì)種類造成誤差快速性復(fù)雜性凱氏定氮法(Kjedahl法)將蛋白質(zhì)蒸餾轉(zhuǎn)化為氨,再用酸吸收后滴定,計(jì)算其含量0.2~1.0低，非蛋白蛋小慢復(fù)雜雙縮脲法(Biuret法)多肽鏈與堿性酮離子生成紫紅色復(fù)合物1~20中等，硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸小快速簡易Folin-酚試劑法(Lowry法)磷鉬酸-磷鎢酸被酪氨酸和苯丙氨酸還原生成藍(lán)色復(fù)合物0.001~0.005嚴(yán)重,硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇大較復(fù)雜紫外分光光度法(UV法)蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基在280nm有光吸收0.01~0.1較嚴(yán)重，各種嘌呤、嘧啶、核苷酸大快速簡單考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合最大光吸收465nm變?yōu)?95nm0.001~0.005低，強(qiáng)堿性緩沖液；TritonX-100；SDS大快速簡單BCA法(bi