基因治療原理與研究進展

第十三章

基因治療原理與研究進展

1根據靶細胞不同，基因治療分為：體細胞(somaticcell)基因治療生殖細胞(germline)基因治療只限于某一體細胞的基因的改變只限于某個體的當代對缺陷的生殖細胞進行矯正當代及子代2基因治療的概念將某個遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發(fā)揮作用，以達到治療疾病目的的方法。31.基因治療的策略

內容提要2.基因轉移技術

4.治療基因的受控表達3.基因干預5.基因治療的應用研究6基因治療的問題與展望4

第一節(jié)基因治療的策略5一、基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因導入特定細胞，通過定位重組，導入的正?；颍灾脫Q基因組內原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進行校正。

特點：對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。6又稱為基因打靶(genetargeting）定向整合的條件:轉導基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列交換?；蛲粗亟M技術7缺陷基因正?；蛑亟M載體正常基因定位重組技術染色體8二、基因添加

(geneaugmentation)定義：通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。類型：在有缺陷基因的細胞中導入相應正?；颍毎麅热毕莼虿⑽闯?，通過導入正?；虻谋磉_產物，補償缺陷基因的功能；向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產物達到治療疾病的目的。9定義：采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結構而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。例如反義核酸、核酶或干擾RNA技術等。三、基因干預（geneinterference）10惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因導入宿主細胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。四、自殺基因治療11自殺基因的作用機制

12TK/GCV：單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine

kinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。（一）自殺基因系統(tǒng)13CD/5-FC：大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在細胞內將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉變成毒性產物5-氟尿嘧啶（5-FU）。（一）自殺基因系統(tǒng)14旁觀者效應：“自殺基因”導入后，不僅使導入了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰或遠處的未轉導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。其明顯增強了自殺基因的腫瘤殺傷作用。（二）旁觀者效應15五、基因免疫治療通過將抗癌免疫增強的細胞因子或主要組織相容性復合體（MHC）基因導入腫瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。16第二節(jié)基因轉移技術

17基因治療的兩種方式載體目的基因invivoexvivo靶細胞將目的基因直接輸入體內將目的基因導入患者靶細胞,體外培養(yǎng)將重組靶細胞回輸體內18基因治療的方式直接體內療法（invivo）是指將目的基因直接導入體內有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。2.間接體內療法（exvivo）是指在體外將目的基因導入靶細胞，經過篩選和增殖后將細胞回輸給患者，使該基因在體內有效地表達相應產物，以達到治療的目的。19

基因轉移(genetransfer)技術：

1.病毒介導的基因轉移系統(tǒng)2.非病毒介導的基因轉移系統(tǒng)20

一、病毒介導的基因轉移系統(tǒng)

病毒載體介導的基因轉移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉錄病毒載體。21（一）逆轉錄病毒（Retrovirus）載體+ssRNA逆轉錄酶核心蛋白膜蛋白人類免疫缺陷病毒（HIV）

22逆轉錄病毒的生活周期Ⅰ23逆轉錄病毒的生活周期Ⅱ24逆轉錄病毒的生活周期Ⅲ25（1）兩端各有一長末端重復序列LTR。

1.逆轉錄病毒前病毒的結構特點（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。U3內有增強子和啟動子；U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)

；在R內還有poly(A)加尾信號。

261.逆轉錄病毒前病毒的結構特點

（3）病毒有三個結構基因：gag、pol和env基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。272.逆轉錄病毒介導的基因轉移系統(tǒng)(1)逆轉錄病毒載體保留病毒顆粒的包裝信號，而缺失病毒顆粒包裝蛋白基因；它可以克隆并表達外源基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。LTRtherapeuticgeneLTR282.逆轉錄病毒介導的基因轉移系統(tǒng)(2)輔助細胞株

它由另一種缺陷型逆轉錄病毒感染構建而成。該細胞株能合成包裝蛋白，用于逆轉錄病毒載體包裝。由于缺乏包裝信號，本身不能被包裝成病毒顆粒。gagpolenv29Retroviralpackagingsystem30逆轉錄病毒結構基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。包裝好的假病毒顆粒易于分離制備。逆轉錄病毒攜帶的遺傳物質高效地進入靶細胞。前病毒通過LTR高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。

3.逆轉錄病毒載體的特點

31

4.

逆轉錄病毒載體的主要缺點

隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；逆轉錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。32

（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體33

（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內吞作用進入細胞內，然后腺病毒基因組轉移至細胞核內，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。

34腺病毒的優(yōu)點1.基因導入效率高；2.宿主范圍廣；3.基因轉導與細胞分裂無關；4.重組腺病毒可通過口服經腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因。35

腺病毒載體缺點2.宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。3.有兩個環(huán)節(jié)可能產生復制型腺病毒：載體與輔助細胞或患者體內野生型病毒發(fā)生重組。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細胞的基因組DNA中。治療基因表達時間相對較短。3637

（三）腺病毒相關病毒載體

(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticles37StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒復制基因,CAP:編碼衣殼蛋白的基因ITR：反向末端重復序列ITRITR38AAV的特點●以潛伏感染為主；●AAV可以高效定點整合至人染色體中：可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達。39

AAV載體的缺陷：

40常用基因治療載體

整合特點安全性感染細胞克隆容量逆轉錄病毒載體隨機整合，效率高可能致病分裂細胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失安全性較高分裂細胞、非分裂細胞

腺相關病毒載體定點整合安全性較高分裂細胞、非分裂細胞<5kb<7.5kb41二、非病毒載體介導的基因轉移系統(tǒng)

（一）脂質體介導的基因轉移技術

基本原理：利用陽離子脂質體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內吞作用將外源DNA（即目的基因）轉移至細胞內，并進行表達。42脂質體介導的基因轉移示意圖43

（二）受體介導轉移技術

將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯，可使DNA具有靶向性。這種偶聯通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。44受體介導轉移技術示意圖45

（三）基因直接注射技術

不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或某些器官組織內。動物實驗：1.將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內毛細血管增加30%～40%；2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；3.肌內注射凝血因子Ⅸ基因，可產生血友病所需的凝血因子Ⅸ。

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基因直接注射法的優(yōu)點1.制備具有調控部件的質粒DNA重組體較容易；2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；3.導入的基因不需整合即可表達；4.基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內免疫應答，致使反復治療效果下降。47第三節(jié)基因干預一、反義RNA二、RNA干擾三、核酶4849一、反義RNA（一）反義RNA與基因表達調控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調控，通常采用的方法有兩種：（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構建一些能轉錄反義RNA的重組質粒，將這些質粒轉入細胞中，轉錄出反義RNA而發(fā)揮作用。4950

反義RNA的關鍵技術問題：?反義RNA進入靶細胞前的降解問題?專一性轉移問題：

50512.受體介導反義RNA技轉移術

①受體介導的RNA轉移十分專一，而且效率高；②被轉移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層,可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。

將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復合物，成為運載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復合物可以專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細胞中，反義RNA進入肝細胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。

借助前述的受體介導基因轉移方法，可以實現受體介導的反義RNA轉移。51

（三）反義RNA的應用前景

（l）安全性高（2）反義RNA設計和制備方便

（3）具有劑量調節(jié)效應

（4）能直接作用于一些RNA病毒52二、RNA干擾（RNAinterference，RNAi）由雙鏈RNA介導的細胞內特異性mRNA降解過程，導致靶基因的表達沉默。5354RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內的某些酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。長雙鏈RNA被細胞內的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。（一）RNA干擾的機制54（一）RNA干擾機制示意圖55（二）RNA干擾的應用前景

1.研究基因功能的新工具

2.腫瘤的基因治療

3.病毒性疾病的基因治療56三、核酶(ribozyme)

具有酶活性的RNA，可降解特異的mRNA序列。與靶序列互補的區(qū)域保守區(qū)域（構成酶活性的結構域）57核酶的作用機制

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（二）核酶的應用

與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結構，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結合和切割其它的mRNA分子。

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第四節(jié)治療基因的受控表達

治療基因的受控表達包括控制治療基因表達的時間、空間和水平三個方面。其策略大致有以下幾種：基因內部調節(jié)機制、基因外部調節(jié)機制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達以及治療基因的誘導表達等。

60?使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件。

例：酪氨酸酶是皮膚細胞和黑色素瘤細胞產生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動子驅動治療基因只在黑色素瘤細胞中表達，而不在正常的周邊細胞中表達。?使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件。例：甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細胞中表達。肝細胞腺癌細胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動子驅動治療基因(如自殺基因)在癌細胞中表達，使癌細胞經給藥后被殺死。一、基因內部的調節(jié)機制61二、基因外部的調節(jié)機制

除利用基因內部的調節(jié)機制以外，還可通過施加外部刺激，比如對病灶局部進行熱處理或電離輻射等，促進治療基因在特定細胞或組織中表達。62三、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達

病灶微環(huán)境與正常時往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達。比如：腫瘤組織往往會出現葡萄糖缺乏或缺氧等微環(huán)境；炎癥組織特殊微環(huán)境等。63四、治療基因的誘導表達

為了防止其表達不再受外界控制，所以有必要開發(fā)和完善一些可誘導性基因表達系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的必要成分：一種是轉錄激活劑，它與DNA結合的活性受某種誘導藥物控制；另一種則是特異性基因表達調控元件，僅對這種轉錄激活劑有所響應。64四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)素抗性基因的轉錄受Tet阻遏蛋白的負調控。無四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達。四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉錄得以進行。。

65Tet-Off系統(tǒng)中，Tet控制的轉錄活化子（tTA）是野生型Tet阻遏蛋白（TetR）與一活化蛋白（AD）的融合體。66Tet-On系統(tǒng)中，TetR中四個氨基酸變化使其結合特性變?yōu)榉聪颍╮TetR)。在Dox存在時與TRE結合。67

第五節(jié)基因治療的應用研究681．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其他血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病一、遺傳病的基因治療研究

69第一例基因治療

－腺苷脫氨酶缺乏癥生理：腺苷脫氨酶是一種細胞內酶，在核酸代謝中起重要作用，使淋巴細胞中的脫氧腺苷脫氨成為脫氧肌苷，最后代謝為尿酸，排出體外。病理：腺苷脫氨酶缺乏－脫氧腺苷不能脫氨－脫氧腺細胞內堆積－淋巴細胞死亡－機體免疫功能缺乏。70治療基礎腺苷脫氨酶基因位于20號染色體長臂1983年腺苷脫氨酶基因被克隆應用逆轉錄病毒可將該基因送入缺乏腺苷脫氨酶基因的淋巴細胞新輸入的腺苷脫氨酶基因可在原來沒有此基因的淋巴細胞中表達

71ADA缺乏癥FrenchAnderson(NIH)LTRADASV40neoLTRSeptember14,199072基因治療的臨床應用AshantideSilvaAshantiwasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy.Injectionsrepeated7timesinfirst10