銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后AQP4表達的影響

銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后AQP4表達的影響劉秀萍，申龍俊，孫巳茵，鄧方

(1.吉林市中心醫(yī)院，吉林吉林132022；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林長春130031)

腦缺血再灌注損傷(cerebralischemiareperfusioninjury，CIRI)可發(fā)生于多種腦血管疾病過程中，而腦水腫是缺血性腦血管病中常見的并發(fā)癥之一。血-腦屏障的通透性與腦水腫密切相關(guān)[1]。星形膠質(zhì)細胞的終足、細胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血-腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。組成血-腦屏障的星形膠質(zhì)細胞膜上有豐富的水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)表達。AQP4是膜水通道蛋白家族的成員之一，在腦組織中廣泛表達，是控制水進出腦組織的通道，在腦水腫[2]、星形細胞遷移[3]、神經(jīng)炎癥及缺血性腦卒中等方面均起著重要作用[4]。銀杏內(nèi)酯(ginkgolide，GK)是銀杏葉提取物中的一類萜內(nèi)酯成分，主要包括單體銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J和白果內(nèi)酯(bilobalide，BB)[5]。目前銀杏內(nèi)酯已廣泛應(yīng)用于臨床，然而迄今銀杏內(nèi)酯及其單體白果內(nèi)酯在腦灌注損傷后的作用機制尚不明確，其對腦缺血后腦水腫方面鮮見文獻報道。為深入探究其對急性腦缺血再灌注損傷的作用機制，本研究從血腦屏障角度，觀察GK和BB對腦缺血的保護作用及對缺血側(cè)皮層AQP4表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠，體重260～280g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2022-0001。

1.2藥物與試劑

銀杏內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供，批號：20220801)，白果內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供，批號：NZ130609，純度>90%)，AQP4抗體(AB3594，Minipore)。

1.3實驗分組

將實驗動物隨機分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型組(MCAO組)、銀杏內(nèi)酯組(GK組)和白果內(nèi)酯組(BB組)。后兩組分別設(shè)不同干預(yù)劑量亞組，即GK2.5組(2.5mg/kgGK腹腔內(nèi)注射)、GK5組(5mg/kgGK腹腔內(nèi)注射)、GK10組(10mg/kgGK腹腔內(nèi)注射)，BB2.5組(2.5mg/kgBB腹腔內(nèi)注射)、BB5組(5mg/kgBB腹腔內(nèi)注射)和BB10組(10mg/kgBB腹腔內(nèi)注射)。模型組及GK、BB各劑量組行MCAO，假手術(shù)組不插線栓。各實驗組及劑量亞組每組實驗大鼠6只。劑量亞組動物于腦缺血再灌注前30min腹腔給藥，假手術(shù)組和MCAO組給予等量生理鹽水。

1.4大鼠腦缺血再灌注模型的制備

實驗采用Longa線栓法制備腦缺血再灌注模型，大鼠左側(cè)MCAO2h再灌注12h。應(yīng)用10%水合氯醛(35mL/kg)腹腔注射麻醉。大鼠仰臥位，四肢固定，去除口腔分泌物，碘伏消毒頸部皮膚，經(jīng)頸正中切口，分離頸部筋膜，沿左側(cè)胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉，暴露頸動脈三角。手術(shù)分離左側(cè)頸總動脈(commoncarotidartery，CCA)、頸外動脈(externalcarotidartery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internalcarotidartery，ICA)，注意伴行的迷走神經(jīng)，防止術(shù)中牽拉導(dǎo)致呼吸心跳驟停。用電凝筆電凝來源于ECA的枕動脈和甲狀腺上動脈，分離ECA主干，其遠心端用細線將血管結(jié)扎，使其無血流通過，在近心端靠近CCA和ECA分叉處用細線在ECA上打一松結(jié)。用稍粗縫合線暫時系緊CCA，用小動脈夾暫時夾閉ICA，在頸外動脈兩條結(jié)扎線間近心端側(cè)上方近剪一倒“V”形切口，將直徑為0.26mm賴氨酸包被的鈍性魚線線栓斜行插入，通過頸內(nèi)動脈推進到大腦中動脈(middlecerebralartery，MCA)，插入約18～20mm遇有阻力時為止，系緊ECA根部絲線去除CCA殘留的粗縫合線。大腦中動脈閉塞2h后行再灌注，小心拔除線栓,手術(shù)線系緊血管殘端，保證MCA血流再通。Sham組僅暴露CCA、ECA及ICA，不做插線處理，余操作相同。縫合肌肉和皮膚。術(shù)前實驗動物禁食一夜，術(shù)前可飲水，避免急性腸梗阻的發(fā)生，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，密切關(guān)注大鼠生命體征變化。

1.5神經(jīng)功能評分、腦梗死體積測定

大鼠缺血2h再灌注12h后，按ZeaLonga5分制評分法對大鼠進行評分。評分標(biāo)準為0分：無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。入組標(biāo)準為：評分為1～3分，且無蛛網(wǎng)膜下腔出血。

大鼠腦缺血2h再灌注12h后，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉后迅速取腦，去除小腦和腦干，于-20℃冰箱中速凍18min，然后將腦組織放入腦槽中，沿腦組織冠狀切面切成5片，隨后將腦片放入2%TTC溶液中，37℃避光置水浴箱30min。染色結(jié)果顯示正常腦組織呈紅色，梗死灶呈白色。再將腦片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6h后，數(shù)碼相機拍照，應(yīng)用圖像分析軟件計算腦片梗死面積并計算腦梗死體積占大腦體積的百分比。

1.6腦組織病理組織學(xué)檢查

大鼠腦缺血再灌注后，用10%水合氯醛麻醉，迅速開胸，用生理鹽水沖洗心臟，然后用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛灌注液，4℃固定1周，依次行脫水、透明、浸蠟及包埋，常規(guī)HE染色封片，光鏡下觀察。

1.7Westernblot檢測AQP4的表達

取缺血側(cè)大腦皮層進行蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜封閉，加入一抗(AQP4，1∶500；β-actin，1∶2000)，4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育，ECL液顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影。采用ImageJ圖像分析測定Westernblot條帶灰度值，結(jié)果以AQP4與β-actin灰度值得比值顯示。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，采用Graphpad軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)采用One-wayANOVA統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較應(yīng)用t檢驗。

2結(jié)果

2.1GK和BB對腦缺血再灌注大鼠腦梗死范圍及神經(jīng)功能缺損的影響

腦缺血