食品安全與微生物污染

食品安全與微生物污染

隨著人們生活水平的提高，食品安全問(wèn)題逐漸成為國(guó)家政府和公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。在眾多食品安全相關(guān)項(xiàng)目中,微生物及其產(chǎn)生的各類(lèi)毒素引發(fā)的污染備受重視。微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中最突出的問(wèn)題。加工食品所含菌的種類(lèi)、數(shù)量,常隨原料的生產(chǎn)環(huán)境及細(xì)菌學(xué)質(zhì)量、工廠環(huán)境與包裝工程的衛(wèi)生及處理狀況、制品貯運(yùn)狀況等而異。食品達(dá)到細(xì)菌學(xué)的衛(wèi)生條件是最終制品中不允許存在致病菌,即使存在食物中毒菌,也必須達(dá)到不損害人體健康的安全水平。由于食品微生物污染的廣泛發(fā)生,嚴(yán)重影響人民的健康,因此食品微生物檢驗(yàn)工作對(duì)評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量,保證消費(fèi)者飲食衛(wèi)生有著極為重要的作用,并且研究靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷的食品安全檢測(cè)技術(shù)和方法,建立和完善食品安全微生物檢測(cè)技術(shù)和體系迫在眉睫。在各種食品生產(chǎn)加工單位均設(shè)有化驗(yàn)室,開(kāi)展食品微生物檢驗(yàn)工作。在食品質(zhì)量監(jiān)測(cè)部門(mén),為了監(jiān)督監(jiān)測(cè)食品生產(chǎn)銷(xiāo)售單位的食品衛(wèi)生質(zhì)量,也都設(shè)有專(zhuān)門(mén)的微生物檢驗(yàn)室,對(duì)食品微生物污染進(jìn)行檢測(cè)和調(diào)查研究。為了更好地開(kāi)展食品微生物檢驗(yàn)和調(diào)查研究工作,提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量,保證消費(fèi)者飲食安全,文章對(duì)微生物的檢驗(yàn)內(nèi)容以及檢驗(yàn)新技術(shù)的研究動(dòng)向進(jìn)行詳細(xì)的介紹。1食品微生物試驗(yàn)的內(nèi)容和特點(diǎn)輕工食品行業(yè)的生產(chǎn)廠家都要進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制,細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌等是細(xì)菌檢驗(yàn)的重要指標(biāo)。1.1食品微生物試驗(yàn)包括食物微生物試驗(yàn)的內(nèi)容食品微生物檢驗(yàn)的內(nèi)容主要有以下幾類(lèi):1.1.1細(xì)菌菌落個(gè)數(shù)(1)細(xì)菌總數(shù)細(xì)菌總數(shù)又稱(chēng)菌落總數(shù),主要作為判斷食品及生活飲用水被污染程度的指標(biāo)。細(xì)菌總數(shù)是指食品及生活飲用水檢樣經(jīng)過(guò)處理,在一定條件下經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后,所得1g或1mc檢樣中所含細(xì)菌菌落個(gè)數(shù)。這一數(shù)據(jù)可以為被檢樣進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。(2)大腸菌群大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24h后能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)配、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便,故以此作為糞便污染指標(biāo)菌評(píng)價(jià)生活飲用水及食品的衛(wèi)生質(zhì)量。大腸菌群數(shù)在食品及水中有不同的含義。食品中的大腸菌群數(shù)是以每100mL(g)樣本中,大腸菌群數(shù)的最近似數(shù)(M、P、N)表示。水中的大腸菌群數(shù)是指1000mL被檢樣品中所發(fā)現(xiàn)的大腸菌群數(shù)。1.1.2志賀氏菌的測(cè)定在GB4798-94食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法中,對(duì)某些微生物的數(shù)量已明確規(guī)定,除要檢測(cè)食品污染程度指示菌,如菌落總數(shù)、大腸菌群(MPN)的測(cè)定外,還有致病菌如金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽胞桿菌都需菌數(shù)計(jì)算。有人研究,志賀氏菌屬傳染劑量在200-10000個(gè)范圍內(nèi);副溶血性弧菌神奈川陽(yáng)性株使人發(fā)生食物中毒的活菌數(shù),少數(shù)情況下約10萬(wàn),超過(guò)1000萬(wàn)時(shí),則半數(shù)以上發(fā)病;產(chǎn)氣莢膜桿菌在引起人們食物中毒的食物中含量超過(guò)106/g則引起食物中毒。Hange.s對(duì)蠟樣芽胞桿菌的研究稱(chēng),一般食品中含菌量為108～109/g便能引起食物中毒,少于此量,不發(fā)病。從上述舉例說(shuō)明,診斷食物中毒反作定性的試驗(yàn)是不夠的,還需對(duì)致病菌定量檢驗(yàn)。筆者認(rèn)為,隨著科技發(fā)展,各種致病菌的定量檢驗(yàn)必將全面開(kāi)展。食品微生物檢驗(yàn)工作者必須不斷摸索,積累致病菌的定量檢驗(yàn),使其他致病菌的定量檢驗(yàn)早日開(kāi)展。1.2微生物指標(biāo)檢驗(yàn)食品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)主要有以下五點(diǎn)。(1)食品微生物檢驗(yàn)涉及的微生物范圍廣,種屬多;采集食品微生物檢驗(yàn)樣品比較復(fù)雜,要求高。食品微生物檢驗(yàn)的范圍包括:(a)經(jīng)食物傳播的病原微生物,是人類(lèi)疾病病原微生物、畜禽疫病的病原微生物、人獸共患傳染病病原微生物。這幾類(lèi)微生物可達(dá)數(shù)百種。(b)引起人類(lèi)食物中毒的微生物及其毒素,如沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、黃曲霉菌等數(shù)十種之多。(c)引起食品腐敗變質(zhì)的微生物。(d)食品工業(yè)微生物,如釀造發(fā)酵工業(yè)用霉菌酵母等曲種、保健食品中雙岐桿菌、乳酸菌等。在食品微生物檢驗(yàn)中,采集樣品極為重要。所采樣品必須有代表性。在采樣時(shí)應(yīng)對(duì)食品的原料來(lái)源、加工方法、運(yùn)輸、保藏條件及銷(xiāo)售中的各個(gè)環(huán)節(jié)等進(jìn)行調(diào)查的基礎(chǔ)上采集有代表性的樣品,采樣在無(wú)菌操作下進(jìn)行,按照不同的檢驗(yàn)?zāi)康?采樣數(shù)量及方法也有所不同,同時(shí)記錄采樣現(xiàn)場(chǎng)的溫度、濕度及衛(wèi)生狀況。(2)食品微生物檢驗(yàn)需要準(zhǔn)確、快速。食品生產(chǎn)后,為了保持新鮮程度,一般都是盡快地進(jìn)人市場(chǎng),轉(zhuǎn)到消費(fèi)者手中,這就要求檢驗(yàn)工作盡快獲得結(jié)果,保證食品的食用安全。另一方面,工廠化大規(guī)模生產(chǎn)的食品,每一批次數(shù)量較大,采樣數(shù)量,采樣方法和檢驗(yàn)方法都直接影響到檢驗(yàn)正確性,如果檢驗(yàn)的結(jié)果不準(zhǔn)確,將會(huì)造成嚴(yán)重的政治影響和經(jīng)濟(jì)損失。(3)食品中待分離細(xì)菌數(shù)量少、雜菌量多,對(duì)檢驗(yàn)工作干擾嚴(yán)重。食品微生物檢驗(yàn)的目的菌,主要來(lái)源于生產(chǎn)加工、貯存運(yùn)輸、銷(xiāo)售等過(guò)程中污染的,在污染的微生物中,致病性微生物一般數(shù)量相對(duì)較少,卻有大量的非致病性微生物污染,兩者之間比例懸殊。另外有些致病菌在熱加工、冷加工中受了損傷,使目的菌不易檢出。上述這些因素給檢驗(yàn)工作帶來(lái)許多麻煩,影響檢驗(yàn)結(jié)果。(4)食品中微生物檢驗(yàn)具有數(shù)量觀念。診斷食物中毒僅作定性試驗(yàn)是不夠的,還需對(duì)致病菌定量檢驗(yàn)。(5)食品微生物檢驗(yàn)具有一定法律性質(zhì)。2微生物指標(biāo)的檢測(cè)食品衛(wèi)生微生物鑒定的傳統(tǒng)方法有:形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清學(xué)分型、噬菌體分型、毒性試驗(yàn)及血清試管凝聚試驗(yàn)等。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)和微電子技術(shù)的飛速發(fā)展,快速、準(zhǔn)確、特異檢驗(yàn)微生物的新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn),微生物檢驗(yàn)技術(shù)由培養(yǎng)水平向分子水平邁進(jìn),并向儀器化、自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化方向發(fā)展,提高了食品微生物檢驗(yàn)工作的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。食品微生物檢驗(yàn)新方法有以下幾種。2.1微生物的檢測(cè)(1)電阻抗法電阻抗法是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)生物學(xué)技術(shù),已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于食品微生物的檢驗(yàn)。其原理是細(xì)菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中,將會(huì)使培養(yǎng)基中的大分子電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等,代謝為具有電活性的小分子物質(zhì),如乳酸鹽、醋酸鹽等,這些離子態(tài)物質(zhì)能增加培養(yǎng)基的導(dǎo)電性,使培養(yǎng)基的阻抗發(fā)生變化,通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基的電阻抗變化情況,判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖特性,即可檢測(cè)出相應(yīng)的細(xì)菌。該法目前已經(jīng)用于細(xì)菌總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等的檢測(cè)。(2)快速酶觸反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測(cè)快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可合成和釋放某些特異性的酶,根據(jù)酶的特性,選用相應(yīng)的底物和指示劑,反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果有助于細(xì)菌快速診斷。如美國(guó)3MPetfifilmTM微生物測(cè)試片可分別快速測(cè)定細(xì)菌總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸菌群等。(3)微量生化法Bachman和Weaver在20世紀(jì)40年代后期首先開(kāi)創(chuàng)了微量生化法的紀(jì)元。隨著人們對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速檢測(cè)的需求增加,使高精密度(90%)和高重現(xiàn)性的商業(yè)試劑盒得以快速發(fā)展。至今,市售的微生物鑒定用試劑盒有多種,常見(jiàn)的有MICRO-ID、API等。API由20個(gè)含干燥培養(yǎng)基的微管組成,其中的培養(yǎng)基用于進(jìn)行酶促反應(yīng)或糖發(fā)酵試驗(yàn)。檢驗(yàn)時(shí)將預(yù)處理的菌懸液加入微管中培養(yǎng)后觀察顏色變化,并記錄,輸入APILABPlus軟件得出結(jié)果。API創(chuàng)建了獨(dú)特的數(shù)值鑒定法,可鑒定15個(gè)系列、600多個(gè)細(xì)菌種。因此具有簡(jiǎn)單、快速、可靠等特點(diǎn)。(4)放射測(cè)量技術(shù)放射測(cè)量技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中代謝碳水化合物的CO2的原理,把微量的放射性14C標(biāo)記引入碳水化合物或鹽類(lèi)等底物分子中進(jìn)行檢測(cè)。在細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí),這些底物被利用并釋放出含放射性的14CO2,然后通過(guò)自動(dòng)化放射測(cè)定儀Bactec測(cè)量14CO2的含量,來(lái)判斷細(xì)菌的數(shù)量。這一方法已用于測(cè)定食品中的細(xì)菌,具有快速、準(zhǔn)確度高和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。減改華等應(yīng)用放射測(cè)量技術(shù)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)。2.2t聚苯乙烯法抗體方法在食品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用廣,根據(jù)檢測(cè)技術(shù)的不同又可分為兩類(lèi):(1)乳膠凝集反應(yīng)利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性,加上人工大分子的乳膠顆粒而發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。AureusTest用于食品樣品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè),該試劑盒中含有對(duì)免疫抗蛋白AIgG和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳膠粒子,因細(xì)菌蛋白A和IgG結(jié)合,凝聚酶和鞭毛抗原結(jié)合,所以當(dāng)含有金黃色葡萄球菌的樣品懸浮液加入含乳膠粒子的試劑盒中時(shí)1min內(nèi)將產(chǎn)生凝集反應(yīng)。該法的靈敏度和特異性均較高。(2)酶聯(lián)免疫吸附法這是用于定性或定量測(cè)定特異抗原抗體的一種技術(shù),它多采用“夾心式”設(shè)計(jì),即用抗體包被聚苯乙烯孔捕獲抗原,用另一個(gè)結(jié)合了酶的抗體與抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,再用一種生色酶底物通過(guò)肉眼觀察或比色法記錄結(jié)果。隨著單克隆抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)的出現(xiàn),免疫檢測(cè)法的特異性有了明顯的提高。2.3核酸探針檢測(cè)技術(shù)(1)核酸探針技術(shù)將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標(biāo)記,加入已變性的被檢DNA樣品中,在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈,從而達(dá)到鑒定樣品中DNA的目的,能認(rèn)識(shí)到特異性核苷酸序列有標(biāo)記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同,可將其分成DNA探針或RNA探針;根據(jù)選用基因的不同分成兩種,一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應(yīng),它對(duì)某些菌屬、菌種、菌株有特異性,另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA發(fā)生雜交反應(yīng),它對(duì)某種微生物中的一種菌株或僅對(duì)微生物中某一菌屬有特異性。核酸探針檢測(cè)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是:①特異性;②敏感性。但探針檢測(cè)技術(shù)中也存在一定的問(wèn)題,如檢測(cè)一種菌就需要制備一種探針;要達(dá)到檢測(cè)量還要對(duì)樣品進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng);探針檢測(cè)是分析基因序列,對(duì)毒素污染的食品有時(shí)因樣品中不含產(chǎn)毒菌而無(wú)法檢測(cè)。(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)基因探針技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用,但主要問(wèn)題是靈敏度不夠高,使基因探針技術(shù)應(yīng)用受到限制。1983年,美國(guó)Getus公司和加利福尼亞大學(xué)的Hulis和Erlich創(chuàng)建了一種能在體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增的簡(jiǎn)易、快速、靈敏和高特異性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),在一定程度上解決了基因探針?biāo)嬖诘膯?wèn)題。其原理為通過(guò)加熱使雙鏈DNA經(jīng)裂解成兩條單鏈,成為引物和DNA聚合酶的模板;然后降低溫度,使寡聚核苷酸引物與DNA分子上的互補(bǔ)序列退火。通常退火溫度越高,擴(kuò)增特異性越好。然后升高溫度,使DNA合成得以進(jìn)行,合成的DNA片斷越大,所需時(shí)間越長(zhǎng)。如此重復(fù)上述加熱變性雙鏈、引物退火和鏈延伸循環(huán)過(guò)程,每次循環(huán)將靶DNA擴(kuò)增一倍。經(jīng)3～4h后,就能使靶DNA擴(kuò)增106。測(cè)定PCR產(chǎn)物的方法較多,如凝膠電泳法、比色測(cè)定法及化學(xué)發(fā)光測(cè)定法等。目前,已有自動(dòng)化PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)儀器,使用方便,雖需增菌且需專(zhuān)用設(shè)備。但PCR技術(shù)是一項(xiàng)全新的技術(shù),快速、靈敏、準(zhǔn)確,在細(xì)菌診斷方面具有廣闊的前景。2.4其他快速檢測(cè)方法隨著微生物快速檢測(cè)法的不斷發(fā)展,很多檢驗(yàn)技術(shù)日趨成熟和完善,并被人們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、研制成自動(dòng)或半自動(dòng)微生物檢測(cè)儀。(1)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)該技術(shù)是用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行自動(dòng)快速定量分析和分選的新技術(shù),具有速度快、精確度高、記數(shù)細(xì)胞量大以及參數(shù)分析、全面測(cè)量細(xì)胞和分選細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。由于FCM檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱與DNA片段的大小成比例,根據(jù)熒光濃度的直方圖就可知道細(xì)菌的DNA指紋圖譜,從而確定細(xì)菌的種類(lèi)?，F(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)能夠檢測(cè)純化的DNA可達(dá)pg級(jí)水平,在10min內(nèi)可以完成數(shù)據(jù)的收集和分析。近年來(lái)在臨床實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)逐步用于病毒、細(xì)菌的檢測(cè)、計(jì)數(shù)、鑒定等。(2)免疫磁性微球免疫磁性分離技術(shù)不但廣泛用于醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,而且在食品衛(wèi)生檢測(cè)方面的應(yīng)用也見(jiàn)端倪。由于食品檢樣常為固液多相混合體,采用常規(guī)方法難以將少量的致病微生物分離出來(lái)。借助免疫磁性分離技術(shù),可以達(dá)到快速分離的目的。免疫磁性分離技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn),可以很快地在含有大量雜菌的懸液中有選擇性地分離出目的微生物,并節(jié)省時(shí)間。(3)電阻電導(dǎo)檢測(cè)器原理是當(dāng)細(xì)菌生產(chǎn)繁殖時(shí),將蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等大分子物質(zhì)分解成氨基酸、有機(jī)酸等帶電荷的小分子物質(zhì),改變培養(yǎng)液的導(dǎo)電度,這樣,測(cè)量電阻和導(dǎo)電度的變化,就可推算出樣品原來(lái)的含菌數(shù)。(4)VITEK-AMS該系統(tǒng)為用于微生物鑒定及藥敏試驗(yàn)的設(shè)備,其原理是將微生物數(shù)碼鑒定的方法與計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合起來(lái),實(shí)現(xiàn)了從讀數(shù)、編碼、解碼、打印結(jié)果的鑒定全過(guò)程的自動(dòng)化。其特點(diǎn)為:①鑒定細(xì)菌類(lèi)型廣;②具有最大的準(zhǔn)確性;③鑒定時(shí)間短;④高度可重復(fù)性;⑤儀器操作方便。(5)VIDAS全自動(dòng)免疫分析儀VIDAS全自動(dòng)化熒光酶標(biāo)免疫測(cè)試系統(tǒng)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)為:全自動(dòng)操作,所有樣品的洗滌、結(jié)合、基質(zhì)讀數(shù)及報(bào)告說(shuō)明等都是全自動(dòng)操作;快速測(cè)定:由樣品進(jìn)入儀器計(jì)算,約需1～2.5h即可出結(jié)果及報(bào)告,容量大