手性物質(zhì)分離分析方法及其應(yīng)用-2010

手性物質(zhì)分離分析方法及其應(yīng)用1第一節(jié)手性的概念及手性物質(zhì)分離意義第二節(jié)手性物質(zhì)分離分析的一般方法第三節(jié)手性色譜分離分析法第四節(jié)手性分離分析方法的應(yīng)用2第一節(jié)手性的概念及手性物質(zhì)分離意義3一、手性及對映異構(gòu)體1、手性的由來

1848年，微生物學(xué)之父法國科學(xué)家路易斯·巴斯德(Louis

Pasteur)在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)兩種酒石酸鹽的晶體形態(tài)。

這兩種晶體的關(guān)系就好像一個(gè)物體與它在鏡子中的映像一樣，擁有相同的物理化學(xué)性質(zhì)，但其水溶液能夠使偏振光的偏轉(zhuǎn)方向不一樣，一種左偏轉(zhuǎn)，另一種右偏轉(zhuǎn)。4更為奇妙的是，當(dāng)把這兩種晶體的溶液等量混合以后，偏振光不發(fā)生偏轉(zhuǎn)。由此，巴斯德斷定酒石酸分子擁有一種鏡像物質(zhì)，它們彼此的旋光性相反，具有不同的空間構(gòu)型。

1904年，英國物理學(xué)家，開爾文勛爵(Lord

Kelvin)在巴爾的摩的一次演講上第一次提出了手性的概念(Chirality)，并且定義為任何一個(gè)不能與其鏡像完全重疊的幾何構(gòu)型或者點(diǎn)群都可以說其具有手性。5

物體與其鏡像不能疊合的現(xiàn)象稱為手性(Chirality)。

兩種互為鏡像關(guān)系且不能重疊的分子稱為手性分子，或?qū)τ钞悩?gòu)體(Enantiomorph)。2、手性及對映異構(gòu)體的定義互為對映體的手性分子63、手性分子的特點(diǎn)

手性分子或?qū)τ钞悩?gòu)體的結(jié)構(gòu)差別很小，具有相同的熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、偶極矩、折光率和光譜性質(zhì)等。與非手性試劑作用時(shí)，其化學(xué)性質(zhì)也一樣，很難用一般的物理或化學(xué)方法區(qū)分。

但它們對平面偏振光的作用不同：一個(gè)會(huì)使平面偏振光向右旋，稱為右旋體；另一個(gè)可使平面偏振光向左旋，稱為左旋體，二者旋轉(zhuǎn)角度相同。因此，對映異構(gòu)也叫做旋光異構(gòu)。7二、手性物質(zhì)的分離意義1、“反應(yīng)?！笔录?/p>

1953年，瑞士的一家藥廠首次合成了一種名為“反應(yīng)?！钡乃幬?。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)停具有一定的鎮(zhèn)靜安眠的作用，而且對孕婦懷孕早期的妊娠嘔吐療效極佳。于是，反應(yīng)停便于1957年正式被推向了市場。此后不久，反應(yīng)停便成了孕婦的理想選擇，在全球被醫(yī)生大量處方給孕婦以治療妊娠嘔吐。8因母體使用反應(yīng)停而致畸性的兒童但后來，歐洲的醫(yī)生們發(fā)現(xiàn)該地區(qū)畸形嬰兒的出生率明顯上升。到了1961年出現(xiàn)畸形胎兒約萬例，這其中有近4000名患兒活了不到一歲就夭折了。反應(yīng)?；瘜W(xué)名稱為沙利度胺(Thalidomide)，分子中具有一個(gè)手性中心，其R異構(gòu)體對孕婦具有鎮(zhèn)靜和安眠用，而S異構(gòu)體則會(huì)無一例外地導(dǎo)致胎兒畸變。9兩種構(gòu)型具有不同活性的手性藥物102、分離意義

手性是人類賴以生存的自然界的本質(zhì)屬性之一。作為生命活動(dòng)基礎(chǔ)的生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、核酸都具有手性的特征。目前人類用于治療各種疾病的化學(xué)藥物很大一部分具有一個(gè)到兩個(gè)手性中心。它們的藥理作用是通過與體內(nèi)大分子之間的嚴(yán)格手性匹配與分子識別來實(shí)現(xiàn)的。許多研究表明，往往是一種立體異構(gòu)體有藥效，而它的鏡像分子藥效很小，甚至完全沒有藥效或具有相反的藥效。11

除藥物之外，涉及面很廣、用途各異的各類精細(xì)化學(xué)品，如殺蟲劑、殺菌劑、昆蟲性信息素、植物生長調(diào)節(jié)劑、食品添加劑、香料等，其分子的光學(xué)異構(gòu)體也常表現(xiàn)出不同的生理活性。因此，研究互為對映體的手性物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，獲得單一的對人體和環(huán)境有益的手性對映體單體，使得手性分離分析技術(shù)的研究與發(fā)展顯得十分必要。12第二節(jié)手性物質(zhì)分離分析的一般方法131、手性源合成法2、結(jié)晶拆分法3、化學(xué)拆分法4、酶拆分法5、膜拆分法6、萃取拆分法7、色譜拆分法（下一節(jié)著重介紹）14一、手性源合成法

手性源合成法是以單一對映體的手性化合物為原料合成另外的手性化合物的單一對映體，這是化學(xué)家最常采用的方法。

由于原料的立體結(jié)構(gòu)決定著產(chǎn)物的立體構(gòu)型，所以獲得制備所需對映體的手性原料就成為這種方法的關(guān)鍵。但是天然手性物質(zhì)的品種和數(shù)量畢竟有限，滿足不了實(shí)際的需求。同時(shí)利用天然手性物質(zhì)衍生出所需的手性化合物，反應(yīng)的步驟較多、難度也較大。15二、結(jié)晶拆分法

結(jié)晶拆分法是基于對映體與純手性物質(zhì)形成非對映體鹽或共價(jià)衍生物，然后利用非對映體的性質(zhì)差異進(jìn)行分離(如分級結(jié)晶)，再將衍生物還原為純對映體。結(jié)晶拆分法分為晶體機(jī)械拆分法和接種結(jié)晶拆分法。

晶體機(jī)械拆分法是將外消旋混合物從溶液中結(jié)晶析出，依據(jù)兩種對映體結(jié)晶形態(tài)的差別，從結(jié)晶物中進(jìn)行手工分離。這一方法耗時(shí)費(fèi)力，僅能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究。16

接種結(jié)晶拆分法是采用加入純對映體之一的晶種，將附在播入的晶種上的同種對映體析出的分步結(jié)晶分離方式。雖然結(jié)晶拆分法操作簡單，但其要耗費(fèi)大量的時(shí)間、勞力和物力，而其實(shí)驗(yàn)與預(yù)期存在很大偏差，因此應(yīng)用面并不廣泛。結(jié)晶拆分法實(shí)例17三、化學(xué)拆分法

此方法是通過化學(xué)反應(yīng)的方法，即用手性試劑將外消旋體中的兩種對映體轉(zhuǎn)化為非對映異構(gòu)體，然后利用非對映異構(gòu)體之間物理化學(xué)性質(zhì)的不同將二者拆分開。拆分成功的關(guān)鍵是選擇合適的拆分劑。

合適的拆分劑應(yīng)該是能夠與對映體生成非對映異構(gòu)體，且溶解度差別較大，經(jīng)拆分后，又易再生為原來的對映體。18雖然這種方法一直被作為重要的拆分方法，但其局限性也很明顯：（1）拆分劑和溶劑的選擇較為盲目；（2）拆分的產(chǎn)率和產(chǎn)品的對映純度不高；（3）適用于手性拆分的對映體的類型不多。19四、酶拆分法

酶對光學(xué)活性異構(gòu)體有選擇性地進(jìn)行酶解作用，使外消旋體中一種光學(xué)異構(gòu)體酶解較快，而另一種酶解較慢，或者不發(fā)生酶解，并在適當(dāng)?shù)臈l件下被保留而達(dá)到分離。

酶催化拆分的主要途徑為主體選擇性水解、酶化和轉(zhuǎn)酶作用。

20酶催化的副反應(yīng)很少、產(chǎn)率高、反應(yīng)的條件也較為溫和，而且酶無毒、易降解、不會(huì)造成環(huán)境污染。但該法僅能適用于酶促反應(yīng)體系，另外酶制劑品種有限、酶易被破壞不穩(wěn)定、制劑的價(jià)格較高也阻礙了其應(yīng)用發(fā)展。21五、膜拆分法

氨基酸的生物轉(zhuǎn)移通常是由埋在生物膜中的載體蛋白來完成的，這種轉(zhuǎn)移的對映體選擇性非常高，膜法拆分對映體正是這種生物過程的模擬。

在各種膜技術(shù)中，選擇性比較好的是使用流動(dòng)載體的液膜。在液膜中，具有手性選擇能力的載體溶解于某種液體溶劑之中，通過與某個(gè)異構(gòu)體特異性的結(jié)合，將其從上相轉(zhuǎn)移到下相，從而實(shí)現(xiàn)對映體的分離。但是由于液膜穩(wěn)定性較差，其工業(yè)應(yīng)用一直受到很大的限制。22為了克服液膜的不穩(wěn)定性，固膜得到了很大的發(fā)展。在固膜中，不同的對映體是通過選擇性擴(kuò)散或吸附來完成跨膜過程的。

選擇性擴(kuò)散固膜一般都不帶有特殊的手性拆分劑，形成選擇性擴(kuò)散的原因是一種異構(gòu)體比另一種異構(gòu)體在固膜中更容易擴(kuò)散。

選擇性吸附固膜主要是利用嵌在聚合物母體中的手性拆分劑與對映體之間特殊的分子間作用來進(jìn)行手性拆分。通常一種異構(gòu)體被較多的選擇性吸附在手性拆分劑上，而另一種異構(gòu)體則較多的游離在聚合物母體之中。23由于選擇性與透過通量之間的反比例關(guān)系，選擇性擴(kuò)散固膜的應(yīng)用受到了限制，只有通過擴(kuò)大膜面積或者增加平衡級數(shù)來彌補(bǔ)，這在實(shí)際應(yīng)用中很不經(jīng)濟(jì)。而選擇性吸附固膜可以在選擇性和透過通量兩方面同時(shí)提高，從而使其在手性拆分工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用成為可能。24六、萃取拆分法

萃取拆分法是利用萃取劑與拆分物中兩對映體的親和作用力的差異或化學(xué)作用的差異來進(jìn)行拆分的一種新型方法。目前有三種萃取拆分分離體系，即親和萃取拆分體系、配位萃取拆分體系、形成非對映立體異構(gòu)體萃取拆分體系。

萃取拆分法除具有傳統(tǒng)液液萃取技術(shù)的特點(diǎn),適用性強(qiáng)、效率高、成本低、可連續(xù)化操作外，還可以實(shí)現(xiàn)萃取拆分過程與外消旋化反應(yīng)一體化。25在拆分過程中使沒有應(yīng)用價(jià)值的對映體能連續(xù)地轉(zhuǎn)化成所需要的對映體，使外消旋化產(chǎn)生的所需對映體萃入萃取相，萃余相中富集的無應(yīng)用價(jià)值的對映體進(jìn)行外消旋化反應(yīng)，從而克服了單純外消旋過程的嚴(yán)重缺陷。與傳統(tǒng)的萃取過程相比，其最大的區(qū)別在于拆分過程中所選擇的萃取劑是具有手性的。因而，萃取劑的選擇也是拆分過程中的關(guān)鍵。26第三節(jié)手性色譜分離分析法27

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)特別是儀器分析技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)把注意力集中在手性化合物的色譜分離方法的研究上。色譜法是最可靠和最常用的測定低含量對映體雜質(zhì)的方法之一，并且是唯一能測定復(fù)雜基質(zhì)中對映體純度的方法。

同時(shí)，色譜法很容易實(shí)現(xiàn)對映體的大規(guī)模制備。色譜技術(shù)已成為當(dāng)前手性分離的主要工具，手性分離也成為色譜科學(xué)的重要的研究對象。

一、手性色譜分離技術(shù)28

常用于手性分離的色譜技術(shù)包括：薄層色譜法(TLC)氣相色譜法(GC)毛細(xì)管電泳(CE)超臨界流體色譜法(SFC)高效液相色譜(HPLC)模擬移動(dòng)床色譜技術(shù)(SMB)（用于對映體大規(guī)模制備）291、薄層色譜(TLC)拆分法

TLC是最簡便的色譜技術(shù)之一，具有操作簡便、設(shè)備簡單、分析速度快、結(jié)果直觀、能快速更換流動(dòng)相系統(tǒng)等特點(diǎn)，已在化學(xué)、化工、生化、醫(yī)藥衛(wèi)生等各個(gè)領(lǐng)域廣泛使用。盡管手性固定相價(jià)格、紫外背景、顯色劑等原因使的目前能用于TLC的手性載體和能被TLC分離的手性化合物很少，但可以預(yù)見它將會(huì)成為手性拆分的重要手段之一，在光學(xué)異構(gòu)體的分離、分析及光學(xué)純度的測定中發(fā)揮重要的作用。30手性固定相薄層板常用的有:(l)纖維素板及預(yù)涂纖維素的薄層板；(2)浸漬手性選擇劑的手性薄層板；(3)分子印跡薄層色譜手性固定相；(4)將手性選擇劑化學(xué)鍵合到載體上，進(jìn)行對映體分離的化學(xué)鍵合手性薄層板，主要有環(huán)糊精鍵合相薄層板、Prickle型薄層板等。312、氣相色譜(GC)拆分法

氣相色譜法是對映體拆分的一個(gè)重要手段。目前氣相色譜中用于分離對映體的固定相主要有三類：手性氨基酸衍生物光學(xué)活性的金屬配合物環(huán)糊精手性固定相。32優(yōu)點(diǎn)：流動(dòng)相簡單分離度和柱效高適合拆分一些不帶芳香環(huán)的對映體化合物（這類對映體在液相色譜條件下通常很難被分離和檢測）缺點(diǎn)：一般要在較高的溫度下進(jìn)行，而這易導(dǎo)致手性選擇劑的消旋化，從而降低其手性識別能力可分離的對映體有限，一般只能分離易于氣化和熱穩(wěn)定性高的對映體化合物。333、毛細(xì)管電泳(CE)拆分法

毛細(xì)管電泳具有簡便、高效、試樣用量少和和幾乎沒有廢液的特點(diǎn)。CE作為一種簡單快捷、經(jīng)濟(jì)方便的現(xiàn)代技術(shù)，在藥物分析和臨床醫(yī)學(xué)研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。毛細(xì)管電泳法分離對映體時(shí)，一般是將手性選擇劑添加到緩沖液中，對映體分子可與手性選擇劑形成具有不同穩(wěn)定性的復(fù)合物，導(dǎo)致遷移速度差異而得到分離。34

手性化合物分離的CE模式按分析對象在溶液中較常用的有毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)

膠束電動(dòng)色譜法(MEKC)

毛細(xì)管電色譜法(CEC)

毛細(xì)管區(qū)帶電泳法CZE是CE中最基本、最普遍的一種模式。各類手性試劑加入到緩沖液中，實(shí)現(xiàn)多種手性異構(gòu)體的分離。35

膠束電動(dòng)色譜法(MEKC)涉及電滲電泳和色譜分配過程，在緩沖液中加入表面活性劑形成膠束相，分離機(jī)理為分析物在水相和膠束相中多次分配以達(dá)到分離目的。膠束體系可分為單一膠束、混合膠束和微乳體系。

CEC是將固定相填充于毛細(xì)管柱內(nèi)或涂布、鍵合于其內(nèi)壁，以電滲流或電滲流結(jié)合壓力流推動(dòng)流動(dòng)相、溶質(zhì)，根據(jù)它們在固定相和流動(dòng)相之間的分配及自身電泳淌度的差異而得以分離。364、超臨界流體(SFC)拆分法

超臨界流體色譜法以超臨界流體（例如液體CO2）為流動(dòng)相對化合物進(jìn)行分離，該技術(shù)常被認(rèn)為是氣相色譜法和液相色譜法的補(bǔ)充。與氣體流動(dòng)相相比，超臨界流體對樣品的溶解度高。與常規(guī)的液體流動(dòng)相相比，超臨界流體粘度低，擴(kuò)散系數(shù)大。SFC分離對映體常用的手性固定相有環(huán)糊精類、多糖類和氨基酸及酰胺類手性固定相。37

具有分析速度快、選擇性好、柱效高等優(yōu)點(diǎn)。適合于熱穩(wěn)定性差以及低揮發(fā)性物質(zhì)的分析。由于其具有很好的環(huán)境友好性，因而將在藥物及代謝產(chǎn)物、天然產(chǎn)物、油脂及食品、農(nóng)業(yè)與環(huán)境樣品分析等諸多領(lǐng)域發(fā)揮一定的作用。優(yōu)點(diǎn)：對儀器要求較高，普及性較差，這在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。缺點(diǎn)：385、高效液相色譜(HPLC)拆分法

基于手性固定相的液相色譜技術(shù)在過去的20年中取得了較大的進(jìn)展，目前已經(jīng)成為藥物研發(fā)領(lǐng)域最為重要的對映體拆分技術(shù)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已有1300多種液相色譜手性固定相被發(fā)展出來，其中至少200種已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品出售。高效液相色譜手性固定相分離測定對映體速度快、柱效高、適用范圍廣(可以用于對熱穩(wěn)定性差和極性農(nóng)藥的分析)且分離能力強(qiáng)，成為了手性藥物分離的首選技術(shù)平臺(tái)之一。39高效液相色譜較氣相色譜和電泳技術(shù)應(yīng)用廣泛的原因，一是由于所有藥物進(jìn)入生物體都是經(jīng)由生物體的體液來運(yùn)輸而進(jìn)一步產(chǎn)生作用而決定的，所以幾乎所有手性藥物都能在高效液相色譜方法中找到適合于其本身特點(diǎn)的分離環(huán)境;二是高效液相色譜更易實(shí)現(xiàn)生物樣品的在線預(yù)處理，能實(shí)現(xiàn)高度的自動(dòng)化，已經(jīng)發(fā)展成對映體分離比較迅速的領(lǐng)域之一。40液相色譜用于對映體分離有直接和間接兩種方法直接法手性流動(dòng)相(chiralmobilephase,CMP)將手性添加劑加入到流動(dòng)相中，與溶質(zhì)的對映體生成一對非對映絡(luò)合物，在普通色譜柱上進(jìn)行分離。優(yōu)點(diǎn)：無需柱前衍生，對色譜填料無特殊要求。缺點(diǎn)：添加劑選擇不當(dāng)會(huì)干擾溶質(zhì)的檢測，可拆分的化合物有限。41手性固定相(chiralstationaryphase,CSP)基于樣品與固定相表面的手性選擇劑形成暫時(shí)的非對映體配合物的能量差異或穩(wěn)定性不同而達(dá)到手性分離。優(yōu)點(diǎn)：制備方便、適用于各類化合物的拆分，是

手性色譜分離對映體的主導(dǎo)方法。缺點(diǎn)：沒有一種廣譜性的色譜固定相，需根據(jù)樣品的結(jié)構(gòu)選擇合適的手性柱42手性衍生化試劑法，即對映體先以手性試劑衍生，形成非對映異構(gòu)體后，再在普通色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離。間接法優(yōu)點(diǎn)：①分離條件相對簡單，只需普通的HPLC條件。

②衍生化后有利于提高紫外或熒光的靈敏度。缺點(diǎn)：①需要高純衍生化試劑。

②各對映體衍生化速率不同。43盡管間接法在某些情況下可降低成本、提高檢測靈敏度，但受制于衍生化試劑(chiralderivatizationreagent,CDR)種類有限以及衍生化反