基因的克隆與表達

基因的克隆與表達山東大學醫(yī)學院免疫學研究所馬春紅基因克隆(geneclonging)基因表達(geneexpression)-原核基因表達-真核基因表達基因克隆GeneCloning概述克隆載體受體細胞體外重組的策略基因克隆工作流程一、概述1973年Cohen完成第一個基因工程實驗經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：限制性內(nèi)切酶連接酶載體受體細胞基因克隆（分子克隆molecullarcloning）----通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體，并導入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。

基因克隆的核心-----體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。

基因克隆的技術(shù)路線目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細胞篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代DNA二、克隆載體三、受體細胞1、定義：外源DNA導入的細胞，是重組體擴增的場所。2、要求：易于接納外源DNA無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶載體復制、擴增不受阻與載體有互補性四、體外重組的策略1、粘末端連接1）全同源粘末端連接最方便簡單高背景-載體自身環(huán)化雙向插入2）定向克?。菏雇庠椿蚨ㄏ虿迦氲捷d體中的克隆策略粘-粘連接：最有效、最快捷粘-平連接：適用于外源基因僅與載體有一個相同酶切位點，可將另一末端補平2、平末端連接：酶切點為平末端或任何兩個末端補平的DNA效率低，酶用量大3、人工接頭連接人工接頭：人工合成含有酶切位點的寡核苷酸片段4、T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，增加延伸時間，Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得1、直接分離3、構(gòu)建cDNA文庫4、PCR5、人工合成6、差異顯示1、直接分離DNA—適用于克隆原核生物的基因組文庫2、構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因基因組文庫(genelibrary)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導入宿主細胞，進行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。構(gòu)建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）特點及應用：包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況3、構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。cDNA文庫僅包含正在表達的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選4、PCR擴增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進行PCR擴增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法5、人工合成較短的DNA6、差異顯示法(differentialdisplay,DD)—篩選差異表達的基因（二）體外重組連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃平末端連接：室溫（低于30℃)DNA量：載體分子數(shù)/目的基因分子數(shù)=1：1-3酶量：平端連接時需加大酶量（三）轉(zhuǎn)化—Cacl2法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定1、篩選：平板法（抗生素、藍白斑）原位雜交2、鑒定：長度鑒定：酶切、PCR方向鑒定：聯(lián)合酶切測序原核基因表達系統(tǒng)一．表達系統(tǒng)：基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達載體及受體細胞。

據(jù)受體細胞的不同可分為：1．原核表達載體系統(tǒng)：將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達系統(tǒng)：使外源基因在真核細胞中表達的體系。二．原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。

多順反子mRNA（polycistronicmRNA）：即可作為兩個或多個肽鏈翻譯模板的mRNA

3、一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)

4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。操縱子（operon）：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位

原核生物基因表達的基本單位（即一個轉(zhuǎn)錄單位）。共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽的表達調(diào)控。包括：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動基因，操作基因)、結(jié)構(gòu)基因：

5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：啟動子終止子

啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

一般長40-60bp，富含A-T鹼基對共有保守序列：-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT-35區(qū)：

RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子，但并不開始轉(zhuǎn)錄各種啟動子啟動轉(zhuǎn)錄能力不同。啟動子強弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列

終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列富含GC的反向重復序列富含AT的序列

轉(zhuǎn)錄形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)6、與轉(zhuǎn)譯有關(guān)的原核細胞結(jié)構(gòu)：——核糖體結(jié)合位點轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長約3-9bpmRNA與30s核糖體亞基間的識別與結(jié)合序列

三．外源基因在原核表達系統(tǒng)中表達的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解

四．影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素：1、啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子