十三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA課件

分子生物學(xué)實驗分子生物學(xué)實驗1實驗?zāi)夸泬A裂解法小量制備質(zhì)粒DNA2.感受態(tài)細(xì)胞制備3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗?zāi)夸泬A裂解法小量制備質(zhì)粒DNA2實驗一堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA實驗一堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA3一、實驗?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的方法一、實驗?zāi)康?二、實驗原理二、實驗原理5分離質(zhì)粒DNA方法堿變性法煮沸法SDS法羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化分離質(zhì)粒DNA方法6堿變性法基本原理在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA堿變性法基本原理在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的7三、實驗材料三、實驗材料8

實驗試劑

ＬＢ培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5g定容1000mlpH7.5NaCl10gＳＴＥ：

0.1MNaCl10mMTrisHCl(pH8.0)1mMEDTAＡｍＰ50mg/ml溶菌酶10mg/ml(用10mMTris·HClpH8.0新鮮配制）

實驗試劑

ＬＢ培養(yǎng)基：9溶液Ⅰ：50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鮮配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚，氯仿，乙醇RNase瓊脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTA溶液Ⅰ：10四、實驗方法

１．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5mlLB培養(yǎng)液中（含AmP50μg/ml），３７℃強(qiáng)烈搖蕩過度２．取1.5ml培養(yǎng)液至Eppendorf管中，12000g離心30秒，棄上清，用１mlSTE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀３．將細(xì)菌沉淀懸浮于100μl預(yù)冷溶液Ⅰ中，振蕩混勻，冰上放置5分鐘四、實驗方法

１．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至5mlLB培養(yǎng)11四、實驗方法

４．加入200μl溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)管蓋輕柔顛倒以混勻內(nèi)容物，冰上放置5分鐘５．加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘６．12000g4℃離心５分鐘，取上清移到１個新的Eppendorf管中７．加入等體積酚/氯仿（１：１），振蕩混勻，12000g4℃離心２分鐘。取上清移至另１個Eppendorf管中四、實驗方法

12

８．加入２倍體積無水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2分鐘。９．12000g,4℃離心５分鐘。10．棄上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴(yán)管蓋顛倒數(shù)次，12000g4℃離心２分鐘。11．棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。12．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA。８．加入２倍體積無水乙醇，振蕩混勻，于室溫靜置2分鐘。13

13．取10μlDNA溶解液用ＴＥ稀釋至1000ul測定OD260和OD280,計算OD260/OD280之比14.同時以以下公式計算得率質(zhì)粒DNA得率：稀釋倍數(shù)×OD260×0.05×50/1.5ml15．取10μlDNA溶解液加2μlLoadingbuffer于1%瓊脂糖,電泳3小時,電壓40伏。16．電泳凝膠在透射式紫外檢測儀上觀察，記錄結(jié)果13．取10μlDNA溶解液用ＴＥ稀釋至1000ul測14五、實驗結(jié)果分析１．根據(jù)質(zhì)粒DNAOD260,OD280值，計算質(zhì)粒DNA得率和DNA純度２．記錄電泳結(jié)果并說明結(jié)果內(nèi)容五、實驗結(jié)果分析15六、思考題

１．簡要敘述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及實驗中分別加入上述溶液后，反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因２．簡要敘述酚氯仿抽提ＤＮＡ體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因六、思考題

１．簡要敘述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及實16實驗二

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備實驗二

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備17實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法18實驗原理感受態(tài)：細(xì)菌能夠吸收外源DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)細(xì)菌經(jīng)低滲氯化鈣處理后，細(xì)胞膨脹、細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過細(xì)胞的狀態(tài)本實驗以E.coliDH5α菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態(tài)實驗原理感受態(tài)：細(xì)菌能夠吸收外源DNA的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)19實驗儀器

實驗儀器20超凈工作臺超凈工作臺21臺式高速冷凍離心機(jī)臺式高速冷凍離心機(jī)22恒溫空氣搖床恒溫空氣搖床23實驗試劑

大腸桿菌DH5α

LB培養(yǎng)基，

0.1mol/LCaCl2溶液（預(yù)冷）實驗試劑

大腸桿菌DH5α24實驗步驟

菌株活化感受態(tài)細(xì)胞制備實驗步驟菌株活化25實驗步驟

菌株活化1．用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時2．挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到3－5mlLB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時3．將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時，到OD600＝0.3－0.4實驗步驟菌株活化26感受態(tài)細(xì)胞制備4．將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上放置15－30min5．6000rpm離心10min,棄上清6．加入0.3ml預(yù)冷的0.1mol/lCaCl2,懸浮沉淀，冰上預(yù)冷10min7．4000rpm離心5min,棄上清8．加入0.2ml預(yù)冷含有甘油的0.1mol/lCaCl2,懸浮沉淀，即為感受態(tài)細(xì)胞，可－70℃長期保存感受態(tài)細(xì)胞制備27思考題1.常用制備感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌有哪些2.第8步中氯化鈣溶液中甘油的作用是什么思考題1.常用制備感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌有哪些28實驗三

氯化鈣誘導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗三

氯化鈣誘導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化29實驗?zāi)康?.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義2.學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法實驗?zāi)康?.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義30轉(zhuǎn)化將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術(shù)轉(zhuǎn)化將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳31電擊法CaCl2、RuCl等化學(xué)試劑法常用轉(zhuǎn)化方法電擊法常用轉(zhuǎn)化方法32實驗原理本實驗以E.coliDH5α菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態(tài)，加入pUC18質(zhì)粒，在鈣離子的作用下，質(zhì)粒與鈣離子形成復(fù)合物吸附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短暫熱刺激，細(xì)胞膜通透性增大，可吸收吸附的質(zhì)粒DNA，即實現(xiàn)轉(zhuǎn)化實驗原理本實驗以E.coliDH5α菌株為受體細(xì)胞，用33實驗原理pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，接受該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性。將轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞于含氨芐青霉素平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡實驗原理pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，接受該質(zhì)粒的34抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基35影響轉(zhuǎn)化率的因素

細(xì)胞生長狀態(tài)和密度轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA質(zhì)量、濃度試劑的質(zhì)量防止雜菌和其它外源DNA污染影響轉(zhuǎn)化率的因素細(xì)胞生長狀態(tài)和密度36實驗儀器

實驗儀器37超凈工作臺超凈工作臺38臺式高速冷凍離心機(jī)臺式高速冷凍離心機(jī)39恒溫空氣搖床恒溫空氣搖床40恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿41實驗試劑

感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α

LB培養(yǎng)基，

0.1mol/LCaCl2溶液（預(yù)冷）

氨芐青霉素

pUC18質(zhì)粒

實驗試劑

感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α42實驗步驟

1.取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上放置30min2.于42℃水浴90S3.冰上放置2min4.加入1mlLB液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)1小時實驗步驟1.取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上43實驗步驟

5.3000rpm離心2min6.吸出上清液0.8ml，將剩余液體輕輕吸打、混合均勻7.將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上8.將平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個小時，然后觀察結(jié)果實驗步驟5.3000rpm離心2min44對照組對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)對照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落

對照組對照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操45轉(zhuǎn)化率

轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)

轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)46

感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)

感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂47實驗結(jié)果實驗結(jié)果48思考題分子生物學(xué)中常用的載體有哪些實驗步驟第4步加入1mlLB液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)1小時的作用是什么思考題分子生物學(xué)中常用的載體有哪些49實驗四聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗四聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）50實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)基本原理與實驗技術(shù)實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)基本原理與實驗技術(shù)51實驗原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。實驗原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainr52PCR技術(shù)原理1.變性：在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性2.退火：是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈PCR技術(shù)原理53(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’354十三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA課件55十三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA課件56十三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA課件57十三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA課件58十三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA課件59溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止溫度（℃）時間（min）9494℃變性（1min）60℃退60

1.引物

2.4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)3.Mg2+4.模板

5.TaqDNA聚合酶

6.反應(yīng)緩沖液PCR反應(yīng)中的主要成份

1.引物PCR反應(yīng)中的主要成份61實驗儀器電泳儀實驗儀器電泳儀62瓊脂糖凝膠電泳槽瓊脂糖凝膠電泳槽63PCR儀PCR儀64凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)65移液器移液器66實驗材料1、DNA模板2、4種dNTP3、引物1、引物24、Taq酶5、瓊脂糖6、DNA相對分子質(zhì)