改良線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型的有效性評(píng)價(jià)

改良線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型的有效性評(píng)價(jià)

采用lagoon法制備大腦中動(dòng)脈阻塞模型（mcoa），不需要打開顱骨，對(duì)動(dòng)物病理刺激小，模型重復(fù)穩(wěn)定，術(shù)后動(dòng)物生活狀況穩(wěn)定。但傳統(tǒng)線栓法MCAO模型需要分離結(jié)扎翼腭動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈,造模時(shí)間長(zhǎng)、動(dòng)物出血多、死亡率高。本研究嘗試僅分離并結(jié)扎頸總動(dòng)脈,于頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處插入線栓,而不分離頸外動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈。通過比較兩種方法制作模型的耗時(shí)、模型成功率、梗死率、死亡率等指標(biāo)以及腦組織形態(tài)學(xué)改變來評(píng)價(jià)改良線栓法制作MCAO的有效性。1材料和方法1.1ley大鼠ley12只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠,體重240～280g,由上海西普爾——必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供質(zhì)量許可證:SYXK(滬)2003-0026。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1蚊香邊的4-0手術(shù)技術(shù)按照ZeaLonga等的方法并稍加改進(jìn)。選用長(zhǎng)3cm,直徑0.22mm的4-0手術(shù)縫線,頭端于蚊香上邊燒灼邊旋轉(zhuǎn),使之成光滑圓球狀。距頭端2.0cm處作好刻度標(biāo)記,硅油浸泡48h使之硅化。1.2.2頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端模型的制作術(shù)前12h禁食,自由飲水。大鼠均選擇右側(cè)大腦為梗塞側(cè),左側(cè)為正常對(duì)照。麻醉前隨機(jī)編號(hào)分為對(duì)照組和模型組。用16%水合氯醛以350mg/kg劑量行腹腔注射麻醉后,仰臥固定于木板上。對(duì)照組:參考ZeaLonga等方法。正中切口約3cm,鈍性分離兩側(cè)甲狀腺,暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū)。分離頸內(nèi)動(dòng)脈至鼓泡,仔細(xì)分離并結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。電凝右側(cè)頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端后,用顯微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈,將頸外動(dòng)脈殘端牽向外下方,使之與頸內(nèi)動(dòng)脈呈一條直線,在頸外動(dòng)脈殘端距頸總動(dòng)脈分支約3mm處剪一小口,將線栓自頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈,輕柔緩慢向前推進(jìn)約(19.5±0.5)mm(自分叉處計(jì)),遇阻力時(shí)即停止進(jìn)線,將線栓與頸外動(dòng)脈共同結(jié)扎以固定線栓,松開動(dòng)脈夾,縫合切口。此時(shí)封閉了大腦中動(dòng)脈開口,阻斷了大腦中動(dòng)脈的血流,制成MCAO模型。阻斷2h后暴露頸部切口,緩慢拔出線栓2～3mm實(shí)現(xiàn)再灌注。動(dòng)物在手術(shù)中及手術(shù)后用白熾燈照射,保持肛溫36℃～37℃。模型組:聯(lián)合曹勇軍等和吳瑩等的方法,不分離和結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。結(jié)扎右頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端后,頸內(nèi)動(dòng)脈近心端掛線,于頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處以顯微剪剪開一小口子,直視下緩慢插入線栓。緩慢推進(jìn)尼龍線至其入顱,遇阻力時(shí)即停止并檢查暴露于動(dòng)脈外的部分,即線栓由頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處計(jì)長(zhǎng)度為(1.9±0.5)mm。若長(zhǎng)度只為(16±0.5)mm左右則需要調(diào)整頸內(nèi)動(dòng)脈方向再次嘗試插入線栓。三次嘗試不行則視為模型制作失敗。其余同對(duì)照組。1.2.3神經(jīng)功能評(píng)估按Zealonga等神經(jīng)功能5分制評(píng)分。術(shù)后評(píng)1～3分者為手術(shù)成功的標(biāo)志。0分、4分及5分均視為模型制作失敗。1.2.4梗死灶體積、整腦體積測(cè)量再灌注24h后行斷頭取腦,按文獻(xiàn)方法自額極開始行連續(xù)冠狀切片,每片厚約2mm,共5片。迅速將腦片置2%TTC溶液中染色,數(shù)碼相機(jī)照相(嘴側(cè)面和尾側(cè)面分別照相),采用Imageproplus5.0軟件測(cè)量各區(qū)面積,參照羅勇等的方法計(jì)算梗死灶體積和整腦體積:V=∑(Sl+S2)?d/2V=∑(Sl+S2)?d/2公式中V為總體積;S1、S2分別表示切片頭側(cè)、尾側(cè)面積;d為切片厚度。計(jì)算梗死灶體積占整腦體積的百分比,用梗死率(infarctionratio)表示梗死灶的大小,將所得值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。1.2.5觀察指標(biāo)記錄模型制作時(shí)間(從切皮至縫合切口,不包括再灌注的時(shí)間),模型成功率,動(dòng)物死亡率,神經(jīng)功能評(píng)分和梗死率。1.3統(tǒng)計(jì)方法各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異用配對(duì)t檢驗(yàn),用SPSS11.5軟件處理。2結(jié)果2.1大鼠解剖結(jié)果對(duì)照組采用傳統(tǒng)方法結(jié)扎翼腭動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈插線栓共有6只,死亡1只。模型制作時(shí)間(30.83±4.62)min,成功率83.33%,死亡率16.67%。死亡大鼠解剖發(fā)現(xiàn)為蛛網(wǎng)膜下腔出血。模型組采用不結(jié)扎翼腭動(dòng)脈,頸總動(dòng)脈插線栓6只全部存活24h以上,除1只多次嘗試仍未成功插入頸內(nèi)動(dòng)脈,其余模型制作均成功。模型制作時(shí)間(20.17±4.88)min,與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)。模型成功率也為83.33%。2.2梗死灶位置檢測(cè)對(duì)照和模型兩組大鼠神經(jīng)功能缺失明顯,分別為2.20±0.84和2.60±0.55;均可見明顯白色梗死灶,梗死率分別為(23.03±7.94)%和(18.65±2.61)%,見圖1。兩組神經(jīng)功能評(píng)分和梗死率差異無顯著意義(P>0.05)。2.3梗死部位大腦皮質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變對(duì)照組和模型組正常側(cè)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,大小一致。胞膜清楚,胞漿均勻,胞核圓大,核膜完整(圖2)。梗死部位大腦皮質(zhì)部分細(xì)胞消失,結(jié)構(gòu)破壞,數(shù)目減少,排列紊亂,細(xì)胞體積大小不一,形態(tài)不規(guī)則,部分細(xì)胞空泡樣變,胞核深染,核膜不清,核仁不明顯。間質(zhì)疏松,呈網(wǎng)狀改變(圖3)。缺血半暗帶明顯,神經(jīng)細(xì)胞稍小,形態(tài)基本正常,排列規(guī)整,部分胞漿均質(zhì)紅染,核膜清楚,間質(zhì)疏松(圖4)(圖1～4見彩插3)。3討論3.1大鼠sd大鼠實(shí)驗(yàn)Markgraf等研究發(fā)現(xiàn),Wistar大鼠MCAO平均腦梗死體積最小,梗死灶變異大;Fischer2334大鼠梗死灶最大,變異最小;而SD居兩者之間。龔彪等研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠較Wistar大鼠出血更少,操作容易。SD大鼠在MCAO后梗死體積較大而恒定,且性溫和、生長(zhǎng)快、價(jià)格便宜,故常用SD大鼠。為排除雌激素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,本實(shí)驗(yàn)使用雄性SD大鼠。在動(dòng)物體重方面,多數(shù)研究認(rèn)為選用280～350g的大鼠較為理想。本人在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)體重大于280g的大鼠模型不易成功,可能與選擇的栓線粗細(xì)不同有關(guān),故本實(shí)驗(yàn)選用體重240～280g之間的雄性SD大鼠。3.2背景線球面線栓制備合適的“線栓”是保證制模成功、梗死體積穩(wěn)定的關(guān)鍵。筆者將4-0普通縫線頭端用蚊香燒灼,邊燙邊旋轉(zhuǎn)縫線使其頭端呈光滑圓球狀,然后置于硅油中48h使之硅化。這樣制成的線栓粗細(xì)合適且可以保持一定的硬度,便于調(diào)整插入角度,避免誤插入翼腭動(dòng)脈。圓形光滑頭端也不易刺破大腦中動(dòng)脈引起蛛網(wǎng)膜下腔出血。3.3永久粘結(jié)頸總動(dòng)脈近心端近年來學(xué)者們對(duì)制作MCAO時(shí)是否能從頸總動(dòng)脈分叉置入線栓以及是否需要結(jié)扎翼腭動(dòng)脈意見不一。Koizumi和ZeaLonga認(rèn)為需要游離結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端及其所有分支,由頸外動(dòng)脈斷端插入栓線。基于這種方法主要是考慮到若從頸總動(dòng)脈分叉出插入線栓就需要結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端,再灌注時(shí)完全依靠Willis環(huán)由對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈供血,可能引起再灌注不足。由于從頸外動(dòng)脈插入線栓不易控制方向,如果線栓比較柔軟則極有可能誤入翼腭動(dòng)脈造成模型失敗。應(yīng)此需要分離結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。本實(shí)驗(yàn)永久結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端,線栓由頸總動(dòng)脈分叉處插入,再灌注完全依靠Willis環(huán)。不游離翼腭動(dòng)脈,而是通過調(diào)整插入線栓方向?qū)⒕€栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈。若線栓誤入翼腭動(dòng)脈,除非已造成頸內(nèi)動(dòng)脈的痙攣,一般都可以通過調(diào)整角度再次插入。實(shí)驗(yàn)中模型組造模時(shí)間顯著短于對(duì)照組,且沒有一只死亡。兩組大鼠梗死率并無顯著差異。研究說明SD大鼠的Willis環(huán)解剖結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,變異較少,通過Willis環(huán)可以達(dá)到再灌的目的。因此完全可以通