改良線栓法大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型的有效性評價

改良線栓法大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型的有效性評價

采用lagoon法制備大腦中動脈阻塞模型（mcoa），不需要打開顱骨，對動物病理刺激小，模型重復穩(wěn)定，術后動物生活狀況穩(wěn)定。但傳統(tǒng)線栓法MCAO模型需要分離結扎翼腭動脈和頸外動脈,造模時間長、動物出血多、死亡率高。本研究嘗試僅分離并結扎頸總動脈,于頸內(nèi)外動脈分叉處插入線栓,而不分離頸外動脈和翼腭動脈。通過比較兩種方法制作模型的耗時、模型成功率、梗死率、死亡率等指標以及腦組織形態(tài)學改變來評價改良線栓法制作MCAO的有效性。1材料和方法1.1ley大鼠ley12只SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠,體重240～280g,由上海西普爾——必凱實驗動物有限公司提供質(zhì)量許可證:SYXK(滬)2003-0026。1.2實驗方法1.2.1蚊香邊的4-0手術技術按照ZeaLonga等的方法并稍加改進。選用長3cm,直徑0.22mm的4-0手術縫線,頭端于蚊香上邊燒灼邊旋轉,使之成光滑圓球狀。距頭端2.0cm處作好刻度標記,硅油浸泡48h使之硅化。1.2.2頸外動脈遠心端模型的制作術前12h禁食,自由飲水。大鼠均選擇右側大腦為梗塞側,左側為正常對照。麻醉前隨機編號分為對照組和模型組。用16%水合氯醛以350mg/kg劑量行腹腔注射麻醉后,仰臥固定于木板上。對照組:參考ZeaLonga等方法。正中切口約3cm,鈍性分離兩側甲狀腺,暴露右側胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū)。分離頸內(nèi)動脈至鼓泡,仔細分離并結扎翼腭動脈。電凝右側頸外動脈遠心端后,用顯微動脈夾暫時夾閉頸總動脈,將頸外動脈殘端牽向外下方,使之與頸內(nèi)動脈呈一條直線,在頸外動脈殘端距頸總動脈分支約3mm處剪一小口,將線栓自頸外動脈插入頸內(nèi)動脈,輕柔緩慢向前推進約(19.5±0.5)mm(自分叉處計),遇阻力時即停止進線,將線栓與頸外動脈共同結扎以固定線栓,松開動脈夾,縫合切口。此時封閉了大腦中動脈開口,阻斷了大腦中動脈的血流,制成MCAO模型。阻斷2h后暴露頸部切口,緩慢拔出線栓2～3mm實現(xiàn)再灌注。動物在手術中及手術后用白熾燈照射,保持肛溫36℃～37℃。模型組:聯(lián)合曹勇軍等和吳瑩等的方法,不分離和結扎翼腭動脈。結扎右頸總動脈遠心端后,頸內(nèi)動脈近心端掛線,于頸總動脈近頸內(nèi)外動脈分叉處以顯微剪剪開一小口子,直視下緩慢插入線栓。緩慢推進尼龍線至其入顱,遇阻力時即停止并檢查暴露于動脈外的部分,即線栓由頸內(nèi)外動脈分叉處計長度為(1.9±0.5)mm。若長度只為(16±0.5)mm左右則需要調(diào)整頸內(nèi)動脈方向再次嘗試插入線栓。三次嘗試不行則視為模型制作失敗。其余同對照組。1.2.3神經(jīng)功能評估按Zealonga等神經(jīng)功能5分制評分。術后評1～3分者為手術成功的標志。0分、4分及5分均視為模型制作失敗。1.2.4梗死灶體積、整腦體積測量再灌注24h后行斷頭取腦,按文獻方法自額極開始行連續(xù)冠狀切片,每片厚約2mm,共5片。迅速將腦片置2%TTC溶液中染色,數(shù)碼相機照相(嘴側面和尾側面分別照相),采用Imageproplus5.0軟件測量各區(qū)面積,參照羅勇等的方法計算梗死灶體積和整腦體積:V=∑(Sl+S2)?d/2V=∑(Sl+S2)?d/2公式中V為總體積;S1、S2分別表示切片頭側、尾側面積;d為切片厚度。計算梗死灶體積占整腦體積的百分比,用梗死率(infarctionratio)表示梗死灶的大小,將所得值用于統(tǒng)計學處理。1.2.5觀察指標記錄模型制作時間(從切皮至縫合切口,不包括再灌注的時間),模型成功率,動物死亡率,神經(jīng)功能評分和梗死率。1.3統(tǒng)計方法各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,兩組間差異用配對t檢驗,用SPSS11.5軟件處理。2結果2.1大鼠解剖結果對照組采用傳統(tǒng)方法結扎翼腭動脈,頸外動脈插線栓共有6只,死亡1只。模型制作時間(30.83±4.62)min,成功率83.33%,死亡率16.67%。死亡大鼠解剖發(fā)現(xiàn)為蛛網(wǎng)膜下腔出血。模型組采用不結扎翼腭動脈,頸總動脈插線栓6只全部存活24h以上,除1只多次嘗試仍未成功插入頸內(nèi)動脈,其余模型制作均成功。模型制作時間(20.17±4.88)min,與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。模型成功率也為83.33%。2.2梗死灶位置檢測對照和模型兩組大鼠神經(jīng)功能缺失明顯,分別為2.20±0.84和2.60±0.55;均可見明顯白色梗死灶,梗死率分別為(23.03±7.94)%和(18.65±2.61)%,見圖1。兩組神經(jīng)功能評分和梗死率差異無顯著意義(P>0.05)。2.3梗死部位大腦皮質(zhì)細胞結構改變對照組和模型組正常側大腦皮層神經(jīng)細胞結構完整,大小一致。胞膜清楚,胞漿均勻,胞核圓大,核膜完整(圖2)。梗死部位大腦皮質(zhì)部分細胞消失,結構破壞,數(shù)目減少,排列紊亂,細胞體積大小不一,形態(tài)不規(guī)則,部分細胞空泡樣變,胞核深染,核膜不清,核仁不明顯。間質(zhì)疏松,呈網(wǎng)狀改變(圖3)。缺血半暗帶明顯,神經(jīng)細胞稍小,形態(tài)基本正常,排列規(guī)整,部分胞漿均質(zhì)紅染,核膜清楚,間質(zhì)疏松(圖4)(圖1～4見彩插3)。3討論3.1大鼠sd大鼠實驗Markgraf等研究發(fā)現(xiàn),Wistar大鼠MCAO平均腦梗死體積最小,梗死灶變異大;Fischer2334大鼠梗死灶最大,變異最小;而SD居兩者之間。龔彪等研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠較Wistar大鼠出血更少,操作容易。SD大鼠在MCAO后梗死體積較大而恒定,且性溫和、生長快、價格便宜,故常用SD大鼠。為排除雌激素對實驗結果的干擾,本實驗使用雄性SD大鼠。在動物體重方面,多數(shù)研究認為選用280～350g的大鼠較為理想。本人在預實驗時發(fā)現(xiàn)體重大于280g的大鼠模型不易成功,可能與選擇的栓線粗細不同有關,故本實驗選用體重240～280g之間的雄性SD大鼠。3.2背景線球面線栓制備合適的“線栓”是保證制模成功、梗死體積穩(wěn)定的關鍵。筆者將4-0普通縫線頭端用蚊香燒灼,邊燙邊旋轉縫線使其頭端呈光滑圓球狀,然后置于硅油中48h使之硅化。這樣制成的線栓粗細合適且可以保持一定的硬度,便于調(diào)整插入角度,避免誤插入翼腭動脈。圓形光滑頭端也不易刺破大腦中動脈引起蛛網(wǎng)膜下腔出血。3.3永久粘結頸總動脈近心端近年來學者們對制作MCAO時是否能從頸總動脈分叉置入線栓以及是否需要結扎翼腭動脈意見不一。Koizumi和ZeaLonga認為需要游離結扎頸外動脈遠端及其所有分支,由頸外動脈斷端插入栓線?；谶@種方法主要是考慮到若從頸總動脈分叉出插入線栓就需要結扎頸總動脈近心端,再灌注時完全依靠Willis環(huán)由對側頸總動脈供血,可能引起再灌注不足。由于從頸外動脈插入線栓不易控制方向,如果線栓比較柔軟則極有可能誤入翼腭動脈造成模型失敗。應此需要分離結扎翼腭動脈。本實驗永久結扎頸總動脈近心端,線栓由頸總動脈分叉處插入,再灌注完全依靠Willis環(huán)。不游離翼腭動脈,而是通過調(diào)整插入線栓方向?qū)⒕€栓插入頸內(nèi)動脈。若線栓誤入翼腭動脈,除非已造成頸內(nèi)動脈的痙攣,一般都可以通過調(diào)整角度再次插入。實驗中模型組造模時間顯著短于對照組,且沒有一只死亡。兩組大鼠梗死率并無顯著差異。研究說明SD大鼠的Willis環(huán)解剖結構相對穩(wěn)定,變異較少,通過Willis環(huán)可以達到再灌的目的。因此完全可以通