枸酸細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法的建立

枸酸細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法的建立

近年來(lái)，藥理學(xué)的應(yīng)用越來(lái)越普遍。他們?cè)谒幬镏苽?、藥物質(zhì)量穩(wěn)定、生物利用和主要藥物副作用等方面發(fā)揮了積極作用。目前有上千種輔料用于不同制劑中,但很大一部分藥用輔料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍未統(tǒng)一。《中國(guó)藥典》2010年版藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)在前版基礎(chǔ)上進(jìn)行了較大的增修,包括國(guó)內(nèi)已經(jīng)生產(chǎn)的常用品種和一些新型輔料,但仍有充實(shí)和完善的空間。藥典中規(guī)定,注射用藥用輔料的熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素等應(yīng)符合要求。但在其正文第二部分中所收載的藥用輔料均未收載細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原檢查項(xiàng)。完善注射劑藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)對(duì)臨床用藥安全具有重要意義。本文就注射劑常用pH值調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑枸櫞酸進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性研究,并建立其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法?？紤]到枸櫞酸的pH值偏酸,故將干擾試驗(yàn)分成稀釋法及中和法兩部分來(lái)進(jìn)行。1試劑tal枸櫞酸(哈藥集團(tuán)三精明水藥業(yè)有限公司,批號(hào)1110006,1110007,1110008,1110009,1110010);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WSE,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)150601-201072,規(guī)格120EU·Amp-1);鱟試劑(TAL,批號(hào)1106070,標(biāo)示靈敏度0.25EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江安度斯生物有限公司;批號(hào)1012201,標(biāo)示靈敏度0.03EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江安度斯生物有限公司;批號(hào)1012140,標(biāo)示靈敏度0.25EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江博康海洋生物有限公司;批號(hào)1004200,標(biāo)示靈敏度0.03EU·mL-1,規(guī)格0.1mL·Amp-1,湛江博康海洋生物有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET,批號(hào)1006180,規(guī)格50mL/瓶,湛江安度斯生物有限公司;批號(hào)1005040,規(guī)格50mL/瓶,湛江博康海洋生物有限公司)。2方法和結(jié)果2.1內(nèi)毒素檢查項(xiàng)《英國(guó)藥典》中,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)中規(guī)定其限值為“Lessthan0.5IU/mg,ifintendedforuseinthemanufactureofparenteraldosageformswithoutafurtherappropriateprocedurefortheremovalofbacterialendotoxins.”,《美國(guó)藥典》中,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)中規(guī)定“Thelevelofbacterialendotoxinsissuchthattherequirementintherelevantdosageform(s)inwhichAnhydrousAnhydrousCitricAcidisusedcanbemet.WherethelabelstatesthatAnhydrousAnhydrousCitricAcidmustbesubjectedtofurtherprocessingduringthepreparationofinjectabledosageforms,thelevelofbacterialendotoxinsissuchthattherequirementintherelevantdosageformmonograph(s)inwhichAnhydrousAnhydrousCitricAcidisusedcanbemet.”,《中國(guó)藥典》中,該品種未收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)。考慮到枸櫞酸作為注射劑輔料,不同制劑所用的量不同,我們參照《英國(guó)藥典》,將其細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為L(zhǎng)=0.5EU·mg-1。2.2內(nèi)毒素靈敏度的測(cè)定根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值,用BET分別將WSE稀釋成2.0,1.0,0.5,0.25λ4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,每一濃度平行做4管,同時(shí)用BET做2支陰性對(duì)照管。按下列計(jì)算鱟試劑靈敏度的測(cè)試值(λc):λc=log-1(ΣX/4);X為反應(yīng)終點(diǎn)內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值,試驗(yàn)結(jié)果見表1～2。由表1～2可見不同靈敏度的兩批鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。2.3干預(yù)試驗(yàn)采用稀釋法2.3.1dna的制備考慮到現(xiàn)市售鱟試劑分別為0.5,0.25,0.125,0.06,0.03EU·mL-1五個(gè)靈敏度。將批號(hào)為1110006的枸櫞酸用BET進(jìn)行稀釋,使其終濃度分別為2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1,將濃度為1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1系列溶液記為NPC;同時(shí)在濃度為2,1,0.5,0.25,0.125mg·mL-1溶液中添加等體積4λ濃度的內(nèi)毒素溶液,使每一濃度試驗(yàn)液中均含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素,將此系列溶液記為PPC。取標(biāo)示靈敏度為0.25EU·mL-1不同廠家的TAL試劑,分別與上述NPC和PPC溶液進(jìn)行反應(yīng),每一濃度重復(fù)做2管,結(jié)果見表3～4。由表3～4預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可初步判斷,0.125mg·mL-1及以下濃度的枸櫞酸對(duì)湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)不存在干擾因素的影響;0.0625mg·mL-1及以下濃度的枸櫞酸對(duì)湛江博康海洋生物制品廠生產(chǎn)的TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)不存在干擾因素的影響。2.3.2wse的干擾考慮到上述干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,使用靈敏度為0.03EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。將枸櫞酸用BET稀釋至終濃度為0.125mg·mL-1的溶液(供試品陰性對(duì)照液)。分別將WSE配成濃度為0.06,0.03,0.015,0.0075EU·mL-1的含供試品(濃度為0.125mg·mL-1)及不含供試品的內(nèi)毒素溶液,用湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)靈敏度為0.03EU·mL-1的TAL進(jìn)行試驗(yàn)。將枸櫞酸用BET稀釋至終濃度為0.0625mg·mL-1的溶液(供試品陰性對(duì)照液)。分別將WSE配成濃度為0.06,0.03,0.015,0.0075EU·mL-1的含供試品(濃度為0.0625mg·mL-1)及不含供試品的內(nèi)毒素溶液,用湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)靈敏度為0.03EU·mL-1的TAL進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(tc)。當(dāng)tc為陰性時(shí),結(jié)果按公式Es=lg-1(ΣXs/4)和Et=lg-1(ΣXt/4)計(jì)算,其中Xs和Xt分別為BET系列和枸櫞酸系列各反應(yīng)終點(diǎn)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值。結(jié)果見表5～6。表5～6結(jié)果表明:Es在0.5λ～2λ之間,且Et在0.5Es～2Es范圍內(nèi)。說(shuō)明0.125mg·mL-1濃度的枸櫞酸在此試驗(yàn)條件下,對(duì)湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的0.06EU·mL-1或靈敏度更高的TAL與WSE反應(yīng)無(wú)干擾;0.0625mg·mL-1濃度的枸櫞酸在此試驗(yàn)條件下,對(duì)湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的0.03EU·mL-1或靈敏度更高的TAL與WSE反應(yīng)無(wú)干擾。2.3.3供試品的制備取標(biāo)示靈敏度為0.03EU·mL-1上述兩個(gè)廠家的TAL試劑進(jìn)行檢驗(yàn),用BET將WSE稀釋成4λ,2λ(陽(yáng)性對(duì)照溶液)濃度的溶液,再將四批枸櫞酸用BET進(jìn)行稀釋,使其終濃度分別為0.12,0.06mg·mL-1的溶液,同時(shí)在濃度為0.12mg·mL-1的溶液中添加4λ的等體積標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液,并設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。結(jié)果見表7～8。表7～8結(jié)果表明,取標(biāo)示靈敏度為0.03EU·mL-1上述兩個(gè)廠家的TAL試劑進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。2.4干擾試驗(yàn)ph調(diào)整法2.4.1不同廠家tal試劑的抗菌材料檢測(cè)用1mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)樣品的pH值至6.0,后用BET進(jìn)行稀釋,使其終濃度分別為2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1,將濃度為1,0.5,0.25,0.125,0.0625mg·mL-1系列溶液記為NPC;同時(shí)在濃度為2,1,0.5,0.25,0.125mg·mL-1溶液中添加等體積4λ濃度的內(nèi)毒素溶液,使每一濃度試驗(yàn)液中均含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素,將此系列溶液記為PPC。取標(biāo)示靈敏度為0.25EU·mL-1不同廠家的TAL試劑,分別與上述NPC和PPC溶液進(jìn)行反應(yīng),每一濃度重復(fù)做2管,結(jié)果見表9～10。由表9～10預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可初步判斷:0.5mg·mL-1及以下濃度的枸櫞酸對(duì)上述兩個(gè)生產(chǎn)廠家的TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)不存在干擾因素的影響。2.4.2抗菌活性的測(cè)定將枸櫞酸用1mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)樣品的pH值至6.0,后用BET進(jìn)行稀釋至終濃度為0.5mg·mL-1的溶液(供試品陰性對(duì)照液)。分別將WSE配成濃度為0.5,0.25,0.125,0.0625EU·mL-1的含供試品(濃度為0.5mg·mL-1)及不含供試品的內(nèi)毒素溶液,用上述兩個(gè)生產(chǎn)廠家的靈敏度為0.25EU·mL-1的TAL進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(tc)。當(dāng)tc為陰性時(shí),結(jié)果按公式Es=lg-1(ΣXs/4)和Et=lg-1(ΣXt/4)計(jì)算,其中Xs和Xt分別為BET系列和枸櫞酸系列各反應(yīng)終點(diǎn)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值。結(jié)果見表11～12。表11～12結(jié)果表明:Es在0.5λ～2λ之間,且Et在0.5Es～2Es范圍內(nèi)。說(shuō)明調(diào)節(jié)pH值后的0.5mg·mL-1濃度的枸櫞酸在此試驗(yàn)條件下,對(duì)上述兩個(gè)生產(chǎn)廠家的0.25EU·mL-1或靈敏度更高的TAL與WSE反應(yīng)無(wú)干擾。2.4.3tal試劑的常規(guī)檢驗(yàn)將枸櫞酸用1mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)樣品的pH值至6.0,取標(biāo)示靈敏度為0.25EU·mL-1的上述兩個(gè)廠家的TAL試劑進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)。結(jié)果見表13～14。表13～14結(jié)果表明,取標(biāo)示靈敏度為0.25EU·mL-1上述兩個(gè)廠家的TAL試劑進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。3工藝優(yōu)化方法枸櫞酸作為注射劑常用的pH值調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑,其熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)符合規(guī)定。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作比較簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度高,重現(xiàn)性