醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測課件

醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測安徽省細菌耐藥監(jiān)控中心安徽醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教研室安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科徐元宏醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測安徽省細菌耐藥監(jiān)控中心1一、醫(yī)院感染1、定義醫(yī)院感染(nosocomialinfection)是指患者在入院時既不存在，亦不處于潛伏期，而在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生的感染，包括醫(yī)院內(nèi)獲得而在出院后發(fā)病的感染。隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，各種侵入性操作和器官移植推廣，化療、糖皮質(zhì)激素、抗生素等廣泛應(yīng)用，醫(yī)院感染是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要問題。一、醫(yī)院感染1、定義22、病原學(xué)細菌為最常見的病原體，細菌的種類與分布因感染類型、醫(yī)院類別、患者基礎(chǔ)疾病和治療措施不同各異。目前，以革蘭陰性桿菌為主(如腸桿菌科和非發(fā)酵菌)，近十余年來抗生素大量應(yīng)用，常見耐甲氧西林葡萄球菌醫(yī)院感染，留置導(dǎo)尿、人工心臟瓣膜等的醫(yī)院感染中凝固酶陰性葡萄球菌感染率上升，手術(shù)切口和尿路腸球菌感染也不少見。厭氧菌和深部真菌作為機體正常菌群常引起內(nèi)源性感染，如腹腔、盆腔感染、菌血癥等。2、病原學(xué)33、感染源引起醫(yī)院感染的病原體來源于住院病人、醫(yī)務(wù)人員、探視者、陪護人員，來自于醫(yī)院環(huán)境及未徹底消毒滅菌的醫(yī)療器械、血液制品的污染菌等，大多為條件性致病菌，且有程度不同的耐藥性。4、易感人群免疫力低下狀態(tài)的住院患者成為感染的易感人群，同時住院期間接受不同種類藥物治療和某些治療措施為病原體感染創(chuàng)造了入侵和繁殖條件。3、感染源4二、醫(yī)院感染病原體的確定

1、感染菌的鑒定：引起醫(yī)院感染的致病菌的鑒定比一般的致病菌的鑒定要求要高，實驗室必須鑒定到種的水平。細菌鑒定依據(jù)表型生化反應(yīng)，八進制的編碼鑒定法，必要時輔助血清學(xué)鑒定。二、醫(yī)院感染病原體的確定1、感染菌的鑒定：52、藥敏試驗的鑒定：藥敏試驗的方法有K-B法、微量液體稀釋法和E-test法，藥敏試驗的結(jié)果除了能提示用于控制感染的藥物外，還提供感染菌的耐藥譜，根據(jù)來自同一感染源的感染菌具有相同耐藥譜的特征，作出醫(yī)院內(nèi)感染的判斷。2、藥敏試驗的鑒定：63、耐藥表型的檢測：醫(yī)院內(nèi)感染菌常常是一些耐藥菌，實驗室應(yīng)對這些細菌的耐藥表型進行檢測。腸桿菌科（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、變形桿菌）應(yīng)作超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽類抗生素的腸球菌（VRE）。3、耐藥表型的檢測：74、醫(yī)院內(nèi)感染的分子生物學(xué)檢測：（1）多位點酶電泳（multilocusenzymeelectrophoresis,MLEE）將菌株培養(yǎng)物破碎，離心取上清液，在淀粉膠上進行電泳，電泳完成后將膠切成小條，分別與不同的酶底物作用進行酶染色，不同的酶分子在不同的電泳位置顯影，組成了菌株的電泳型。當(dāng)酶分子的基因發(fā)生一個或多個位點變異時，電泳遷移率相應(yīng)發(fā)生變化。4、醫(yī)院內(nèi)感染的分子生物學(xué)檢測：8（2）限制性片段長度多態(tài)性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）將菌株培養(yǎng)物破碎，提取DNA，以限制性內(nèi)切酶進行切割后，在瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳后作溴乙啶染色，通過分析電泳區(qū)帶圖譜對菌株進行鑒別；可以將電泳分離的核酸片段轉(zhuǎn)印到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，用標(biāo)記的探針與之雜交，用于菌株的鑒別。（2）限制性片段長度多態(tài)性分析（restrictionfr9（3）多態(tài)DNA的隨機放大(randomamplificationofpolymorphicDNA,RAPD)多態(tài)DNA的隨機放大又稱隨機引物PCR，在菌株的DNA提取物中加入約10個堿基的隨機引物，進行PCR擴增，然后將PCR產(chǎn)物進行電泳和溴乙啶染色，分析染色圖譜可用于菌株的鑒別。（3）多態(tài)DNA的隨機放大(randomamplifica10（4）脈沖場凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE）將菌體包埋于瓊脂中，先后用酶破壞細胞壁和分解蛋白質(zhì)，以切點較少的內(nèi)切酶剪切細菌的DNA，以隨時變更電場方向的電泳裝置對大片段DNA進行電泳，根據(jù)電泳圖譜對菌株進行識別。（4）脈沖場凝膠電泳（pulsed-fieldgelel11醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測課件12（5）放大片段長度的多態(tài)性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）對菌株的DNA進行限制性酶切，然后用特定的引物從限制性片段中將相應(yīng)的片段選出，經(jīng)PCR擴增后再進行電泳分析。（6）核酸序列分析(nucleotidesequenceanalysis)用PCR的方法將菌株DNA的某一片段進行擴增放大，然后進行測序，對各分離菌株的序列進行比較。（5）放大片段長度的多態(tài)性分析（amplifiedfrag13三、藥敏試驗藥敏試驗中藥敏紙片選用：臨床醫(yī)生經(jīng)常反映，實驗室所報告的藥敏試驗結(jié)果，臨床根本或很少使用這類藥物，實驗室藥敏試驗中藥物是敏感，臨床使用無效。如何聯(lián)合用藥、合理用藥？實驗室人員應(yīng)根據(jù)可能的細菌種類、細菌的菌屬，合理選用藥敏紙片，報告檢驗結(jié)果。實驗室應(yīng)根據(jù)美國FDA推薦臨床微生物實驗室苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌分組的藥物選用，它將藥物分為四組：A組，一級試驗并常規(guī)報告的抗生素；B組，一級有選擇報告的抗生素；C組，補充試驗，有選擇報告的抗生素；U組，用于泌尿道補充試驗的藥物。三、藥敏試驗藥敏試驗中藥敏紙片選用：臨床醫(yī)生經(jīng)常反映14例如對于腸桿菌科細菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、慶大霉素；選擇報告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、頭孢孟多或頭孢尼西或頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢美唑、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢噻肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、環(huán)丙沙星或左氧氟沙星、亞胺培南或美羅培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑。例如對于腸桿菌科細菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、頭孢唑啉、頭15對于銅綠假單胞菌和不動桿菌常規(guī)報告的抗生素有頭孢他啶、慶大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，選擇報告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、頭孢哌酮、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南或美羅培南、妥布霉素。對于銅綠假單胞菌和不動桿菌常規(guī)報告的抗生素有頭孢他啶16對于葡萄球菌常規(guī)報告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，選擇報告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或紅霉素、克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、萬古霉素。對于腸球菌常規(guī)報告的抗生素有青霉素/氨芐西林，選擇報告的抗生素有萬古霉素。對于葡萄球菌常規(guī)報告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，選擇報告的17對于嗜血桿菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報告的抗生素有頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢呋辛鈉（針劑）、氯霉素、美羅培南。對于嗜血桿菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑18對于肺炎鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報告的抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、萬古霉素。對于肺炎鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉素（苯唑青霉素）19對于除肺炎鏈球菌以外其它鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉素、氨芐西林，選擇報告的抗生素有氯霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢吡肟或頭孢他啶或頭孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/達福普汀。對于除肺炎鏈球菌以外其它鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉20對于淋球菌常規(guī)報告β-內(nèi)酰胺酶結(jié)果，如β-內(nèi)酰胺酶陽性提示青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥，但淋球菌更多的是染色體介導(dǎo)的耐藥，需要做補充藥敏試驗，選擇報告的抗生素有頭孢克肟或頭孢噻肟或頭孢泊肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大觀霉素、四環(huán)素。對于淋球菌常規(guī)報告β-內(nèi)酰胺酶結(jié)果，如β-內(nèi)酰胺酶陽性提示青21遵循嚴格的操作方法、施加質(zhì)量控制：紙片擴散法（K-B））法、液體稀釋法必須遵循NCCLS規(guī)定，它對紙片厚度、藥物濃度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境、孵育溫度、操作方法都有詳細規(guī)定。E-test必須按照其說明要求進行。遵循嚴格的操作方法、施加質(zhì)量控制：22運用豐富的理論知識，提示臨床用藥：對于腸道分離的沙門菌和志賀菌屬，常規(guī)僅測試氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和TMP/SMZ藥物，1、2代頭孢菌素盡管體外敏感，但臨床治療無效，實驗室不能做此藥敏試驗。對于腸道外分離株，沙門氏菌屬還一定要測試并報告氯霉素和某一種三代頭孢菌素。對于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐慶大霉素腸球菌、AmpC-β-內(nèi)酰胺酶應(yīng)有所選擇性報告藥敏結(jié)果，有時體外藥敏結(jié)果是敏感的也要報告耐藥。運用豐富的理論知識，提示臨床用藥：對于腸道分離的沙門菌和志賀231.藥敏試驗種類和方法：（1）細菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法（2）酵母樣真菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法淺部真菌目前尚沒有標(biāo)準(zhǔn)方法。1.藥敏試驗種類和方法：24細菌藥敏試驗-紙片擴散法Kirby-BaueragardiskdiffusionPaperdiskcontainingantibioticisplacedonlawnofbacteria,thenincubatedovernight.DiameterofzoneofinhibitionisinverselyrelatedtoMIC(usedtoestablishinterpretivebreakpoints).Standardizedforcommonlyisolated,rapidlygrowingorganisms.細菌藥敏試驗-紙片擴散法Kirby-Baueragard25醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測課件26細菌藥敏試驗-液體稀釋法Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104

cfu4210.50.250.120mg/ml細菌藥敏試驗-液體稀釋法Minimalinhibitory27細菌藥敏試驗-E-test法E-testStripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.細菌藥敏試驗-E-test法E-test28四、細菌耐藥機制的檢測1.甲氧西林葡萄球菌的檢測：MRSA(Methicillin-resistantStaphylococusaureus)、MRSCON（Methicillin-resistantcoagulatase-negativeStaphylococcalspecies）檢驗：四、細菌耐藥機制的檢測1.甲氧西林葡萄球菌的檢測：29（1）．紙片擴散（K-B）法由于苯唑青霉素較甲氧西林青霉素穩(wěn)定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素測定葡萄球菌。M-H瓊脂平板，直接菌落懸液法，苯唑青霉素紙片含量為1μg/片，35℃24小時孵育，抑菌圈直徑《10mm。2004年NCCLS推薦耐甲氧西林葡萄球菌評判標(biāo)準(zhǔn):采用頭孢西丁紙片（30μg）,孵育24小時,對于金黃色葡萄球菌抑菌圈≤19mm為MRSA，≥20mm為MSSA;對于凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈≤24mm為MRSCON，≥25mm為MSSCON.（1）．紙片擴散（K-B）法30醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測課件31(2).瓊脂稀釋法篩選試驗：苯唑青霉素耐藥培養(yǎng)基：含NaCL的M-H瓊脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6μg/ml苯唑青霉素或10μg/ml甲氧西林接種：直接菌落懸液約0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，用拭子浸潤菌懸液后，在平板表面點種或劃線。培養(yǎng)條件：35℃空氣培養(yǎng)時間：24小時，對于甲氧西林/苯唑青霉素耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌，孵育48小時后再檢測最可靠。結(jié)果：>1菌落=耐藥推薦質(zhì)控菌：金黃色葡萄球菌ATCC29213—敏感，金黃色葡萄球菌ATCC43300-耐藥(2).瓊脂稀釋法32目前治療方案：MRS輕度感染：利福平、SMZ-TMP、環(huán)丙沙星；嚴重感染：萬古霉素。對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌稱之為VRSAVancomycin-risistantS.aureus只能用鏈陽霉素治療。目前金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥尚不多見，國外學(xué)者將腸球菌耐萬古霉素基因轉(zhuǎn)移到金黃色葡萄球菌中已獲得成功；日本、香港散在報道且僅萬古霉素低度耐藥（MIC8μg/ml），且國際上尚未承認；2002年6月美國從一40歲患有糖尿病、慢性腎臟衰竭患者導(dǎo)管中分離到對苯唑青霉素MIC>16μg/ml,對萬古霉素MIC>128μg/ml的耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌，VRSA就在我們眼前。目前治療方案：MRS輕度感染：利福平、SMZ-TMP、環(huán)丙332.腸球菌的檢測：腸球菌是一種重要的病原微生物，實驗室應(yīng)做高耐慶大霉素腸球菌的檢測。若高耐慶大霉素，則不能和作用細胞壁的藥物（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）協(xié)同使用。有條件的實驗室還應(yīng)作VanA,VanB,VanC耐藥基因監(jiān)測。治療原則：VanA：青霉素敏感（S），氨基糖苷類非高耐--青霉素+慶大霉素；青霉素耐藥（R），氨基糖苷類非高耐--青霉素/頭孢類+壁霉素+慶大霉素。VanB：氨基糖苷類非高耐株--壁霉素+慶大霉素。氨基糖苷類高耐株--壁霉素，新生霉素+氟喹諾酮類。多重耐藥的腸球菌目前尚無有效的治療方案。2.腸球菌的檢測：34醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測課件35（2）．腸球菌高水平氨基糖苷類耐藥和萬古霉素耐藥篩選試驗（瓊脂稀釋法）篩選試驗慶大霉素HLAR抗生素含量：500ug/ml接種：液體生長法或直接菌落法至0.5麥?zhǔn)媳葷峁?。瓊?10ul0.5麥?zhǔn)媳葷峁軕乙狐c種在瓊脂表面。孵育條件35℃空氣孵育時間24小時結(jié)果：瓊脂：>1菌落=耐藥；肉湯：任何生長=耐藥,耐藥-不能和作用細胞壁的藥物協(xié)同（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素），敏感-可以和敏感的作用于細胞壁的藥物協(xié)同（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）。質(zhì)控菌株：糞腸球菌ATCC29212-敏感；糞腸球菌ATCC51299-耐藥（2）．腸球菌高水平氨基糖苷類耐藥和萬古霉素耐藥篩選試驗（瓊36篩選試驗

鏈霉素HLAR抗生素含量：

肉湯1000ug/ml、瓊脂2000ug/ml接種：肉湯-推薦標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法。液體生長法或直接菌落法至0.5麥?zhǔn)媳葷峁?。瓊?10ul0.5麥?zhǔn)媳葷峁軕乙狐c種在瓊脂表面。孵育條件：35℃空氣孵育時間：24-48小時（如孵育24小時為敏感時，需繼續(xù)孵育）結(jié)果：瓊脂：>1菌落=耐藥；肉湯：任何生長=耐藥,耐藥-不能和作用細胞壁的藥物協(xié)同（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素），敏感-可以和敏感的作用于細胞壁的藥物協(xié)同（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）。質(zhì)控菌株：糞腸球菌ATCC29212-敏感；糞腸球菌ATCC51299-耐藥篩選試驗鏈霉素HLAR37篩選試驗：

萬古霉素耐藥抗生素含量：6ug/ml接種：肉湯-推薦標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法。液體生長法或直接菌落法至0.5麥?zhǔn)媳葷峁堋?-10ul0.5麥?zhǔn)媳葷峁軕乙狐c種在瓊脂表面。孵育條件：35℃空氣孵育時間：24小時結(jié)果：

>1菌落=耐藥進行萬古霉素MIC測定和動力試驗產(chǎn)生的色素來區(qū)別獲得性耐藥（VanA,VanB）和那些對萬古霉素天然的中水平耐藥（VanC）如敦雞腸球菌、鉛腸球菌和黃腸球菌，它們通常在萬古霉素篩選平板上生長。質(zhì)控菌株：糞腸球菌ATCC29212-敏感；糞腸球菌ATCC51299-耐藥篩選試驗：萬古霉素耐藥383.超廣譜β–內(nèi)酰胺酶檢測：超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌等革蘭氏陰性桿菌在抗生素選擇壓力下產(chǎn)生。它是質(zhì)粒介導(dǎo)的對第一、二、三頭孢菌素、氧亞氨基β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，有時盡管體外試驗是敏感的，是β-內(nèi)酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突變而來。ESBLs編碼基因在質(zhì)粒上，易在不同菌株間播散，表現(xiàn)為多重耐藥。目前將ESBLs分為TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特點是能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。

3.超廣譜β–內(nèi)酰胺酶檢測：39治療原則是：1.碳青霉烯類抗生素，2.β-內(nèi)酰胺類/酶抑制劑,3.氨基糖苷類抗生素如阿米卡星，4.頭霉烯抗生素如頭孢西丁。在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測條件不具備的地方，臨床可以通過實驗室報告的作推測治療，若藥敏報告提示三代頭孢例如頭孢潑肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢曲松有二者以上耐藥極有可能是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。治療原則是：1.碳青霉烯類抗生素，2.β-內(nèi)酰胺類/酶抑制40(1)．紙片初篩：培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度:頭孢潑肟10ug或頭孢他啶30ug或氨曲南30ug或頭孢噻肟30ug或頭孢曲松30ug（使用兩個以上紙片做篩選試驗可提高檢出靈敏度）接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法孵育條件：35℃大氣環(huán)境孵育時間：16-18小時結(jié)果：頭孢泊肟抑菌環(huán)≤22mm，頭孢他啶抑菌環(huán)≤22mm，氨曲南抑菌環(huán)≤27mm，頭孢噻肟抑菌環(huán)≤27mm，頭孢曲松抑菌環(huán)≤25mm，=可能產(chǎn)生ESBL。建議質(zhì)控方法:大腸埃希菌ATCC25922（參考NCCLS抑菌標(biāo)準(zhǔn)）

肺炎克雷伯菌ATCC700603:頭孢潑肟抑菌環(huán)9-16mm,頭孢他啶抑菌環(huán)10-18mm,氨曲南抑菌環(huán)9-17mm,頭孢噻肟抑菌環(huán)17-25mm,頭孢曲松抑菌環(huán)16-24mm。(1)．紙片初篩：41紙片確證試驗：培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度：頭孢噻肟30ug、頭孢噻肟/棒酸30ug/10ug和頭孢他啶30ug、頭孢他啶/棒酸30ug/10ug（確證試驗須使用頭孢噻肟、頭孢他啶及兩者與棒酸的混合紙片）接種：按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法孵育條件：35℃大氣環(huán)境孵育時間：16-18小時結(jié)果：混合棒酸藥物紙片的抑菌圈直徑比無棒酸藥物紙片的直徑大5mm以上=ESBL建議質(zhì)控方法：大腸埃希菌ATCC25922單獨藥物和混合棒酸藥物兩種紙片的抑菌環(huán)直徑相差不大于2mm。肺炎克雷伯菌ATCC700603：頭孢他啶單獨藥物和混合棒酸藥物紙片抑菌環(huán)較頭孢他啶單獨藥物紙片抑菌環(huán)直徑增大5mm以上，頭孢噻肟單獨藥物和混合棒酸藥物紙片抑菌環(huán)較頭孢噻肟單獨藥物紙片抑菌環(huán)直徑增大3mm以上。紙片確證試驗：42醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測課件43液體稀釋法初篩:培養(yǎng)基：CAMHB（調(diào)節(jié)好陽離子的M-H肉湯）抗生素濃度：頭孢潑肟4ug/ml或頭孢他啶1ug/ml或氨曲南1ug/ml或頭孢噻肟1ug/ml或頭孢曲松1ug/ml（使用1種以上藥物做篩選試驗可提高檢出靈敏度）接種：按標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法的規(guī)定進行孵育條件：35℃；空氣孵育時間：16-18小時結(jié)果判讀：生長=可疑有ESBLS的產(chǎn)生（即頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢曲松MIC≥2ug/ml；頭孢潑肟MIC≥8ug/ml

）質(zhì)控建議：大腸埃希氏菌ATCC25922不長肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，頭孢潑肟MIC≥8ug/ml液體稀釋法初篩:44液體稀釋法確證:

培養(yǎng)基: CAMHB藥物濃度: 頭孢他啶0.25-128ug/ml,頭孢他啶/克拉維酸0.25/4-128/4ug/ml和頭孢噻肟0.25-64ug/ml,頭孢噻肟/克拉維酸0.25/4-64/4ug/ml。確證試驗需要同時使用頭孢他啶、頭孢噻肟，單獨和聯(lián)合克拉維酸復(fù)合制劑。接種: 按標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法的規(guī)定進行孵育條件: 35℃空氣孵育時間: 16-20小時結(jié)果判讀: 對2個中任何一個藥物的MIC，在加入克拉維酸后，MIC與不加克拉維酸的MIC值降低3個以上對倍稀釋度，判定為ESBLs（如頭孢他啶的MIC=8ug/ml，頭孢他啶/克拉維酸的MIC為1ug/ml）。質(zhì)控建議:肺炎克雷伯菌ATCC700603：聯(lián)合克拉維酸的復(fù)合制劑的MIC與單藥的MIC相比，應(yīng)當(dāng)降低3個以上對倍稀釋度。液體稀釋法確證:452005年NCCLS新增奇異變形桿菌的ESBL試驗藥物紙片篩選(mm)MIC篩選(μg/ml)大腸/肺克MIC篩選(μg/ml)奇異變形頭孢泊肟10μg17

8

2*頭孢他啶30

μg

22

2

2氨曲南不用

2不用頭孢噻肟30

μg

27

2

2頭孢曲松不用

2不用*只用于奇異變形桿菌(大腸桿菌和肺克是

8μg/ml)

2005年NCCLS新增奇異變形桿菌的ESBL試驗藥物紙片46用標(biāo)準(zhǔn)ESBL表型確證試驗,無改變RoutinescreeningnotrecommendedPerformESBLtestwhenclinicallyrelevant(e.g.,bacteremia)ConsultwithmedicalstafftodeterminewhentotestPracticalapproach,teststerilebodysiteisolatesUsestandardESBLscreentestwithslightmodificationDrug DiskScreenMICScreen用標(biāo)準(zhǔn)ESBL表型確證試驗,無改變47ESBL試驗QC頻率紙片法和MIC法篩選試驗表型確證試驗每天/每周QC肺克ATCC700603*或大腸桿菌ATCC25922QA肺克ATCC700603*每天/每周QC

肺克ATCC700603*和大腸桿菌ATCC25922*ESBL基因在質(zhì)粒上;QC株必需儲存在-60

C或以下ESBL試驗QC頻率紙片法和MIC法篩選試驗表型484、D試驗-克林霉素誘導(dǎo)耐藥試驗：葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥表現(xiàn)為：①由msrA基因介導(dǎo)的主動外排機制，即M型耐藥；②抗生素作用靶位的改變，即由erm基因編碼的RNA甲基化酶對細菌核糖體50S亞基23SrRNA進行特定核苷酸殘基甲基化，使藥物與靶位的結(jié)合能力下降，導(dǎo)致對具有相同靶位的大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、鏈陽菌素B三類藥物同時耐藥，臨床稱為MLS型耐藥。體外藥敏試驗又可將MLS型分為結(jié)構(gòu)型（cMLS型）和誘導(dǎo)型（iMLS型）；cMLS型為紅霉素和克林霉素均耐藥；iMLS型紅霉素耐藥、克林霉素敏感。4、D試驗-克林霉素誘導(dǎo)耐藥試驗：49

對大環(huán)內(nèi)酯耐藥的葡萄球菌可能對克林霉素的耐藥,通過erm基因編碼的23SrRNA甲基化也稱為MLSB（大環(huán)內(nèi)酯、林可和B型鏈陽霉素）耐藥，或只對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥（由msrA基因編碼的外排機制）。對大環(huán)內(nèi)酯耐藥的葡萄球菌可能對克林霉素的耐藥,通50

M-H平板或血平板，紙片相鄰試驗，對于葡萄球菌，距紅霉素紙片（15μg/片）邊緣15～26mm處放置克林霉素紙片(2μg/片)來進行檢測；對于β-溶血鏈球菌，將克林霉素紙片(2μg/片)和紅霉素紙片（15μg/片）貼在相鄰的位置，紙片邊緣相距12mm。M-H平板或血平板，紙片相鄰試驗，對于葡萄球菌51

35℃空氣，16-24h孵育后，克林霉素抑菌環(huán)不出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，應(yīng)報告分離株對其敏感。鄰近紅霉素紙片側(cè)克林霉素抑菌環(huán)出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象（稱為“D”抑菌環(huán)），提示存在可誘導(dǎo)的克林霉素耐藥，應(yīng)報告分離株對其耐藥，在報告中應(yīng)注明“通過誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗，推測此菌株對克林霉素耐藥，克林霉素對某些病人可能仍有效”；若無“截平”現(xiàn)象，則應(yīng)報告菌株對克林霉素敏感。35℃空氣，16-24h孵育后，克林霉素抑菌環(huán)52醫(yī)院感染病原微生物鑒定及其耐藥機制檢測課件53謝謝！謝謝！541、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味著終身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportunity.(RichardNixon,AmericanPresident)命運給予我們的不是失望之酒，而是機會之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5日星期三3、Patienceisbitter,butitsfruitissweet.(JeanJacquesRousseau,Frenchthinker)忍耐是痛苦的，但它的果實是甜蜜的。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.20204、Allthatyoudo,dowithyourmight;thingsdonebyhalvesareneverdoneright.----R.H.Stoddard,Americanpoet做一切事都應(yīng)盡力而為，半途而廢永遠不行8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:105、Youhavetobelieveinyourself.That'sthesecretofsuccess.----CharlesChaplin人必須相信自己，這是成功的秘訣。-Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/20206、Almostanysituation---goodorbad---isaffectedbytheattitudewebringto.----LuciusAnnausSeneca差不多任何一種處境---無論是好是壞---都受到我們對待處境態(tài)度的影響。11時3分11時3分5-Aug-208.5.20207、Althoughtheworldisfullofsuffering,itisfullalsooftheovercomingofit.----HellenKeller,Americanwriter雖然世界多苦難，但是苦難總是能戰(zhàn)勝的。20.8.520.8.520.8.5。2020年8月5日星期三二〇二〇年八月五日8、Formanismanandmasterofhisfate.----Tennyson人就是人，是自己命運的主人11:0311:03:108.5.2020Wednesday,August5,20209、Whensuccesscomesinthedoor,itseems,loveoftengoesoutthewindow.-----JoyceBrothers成功來到門前時，愛情往往就走出了窗外。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.202010、Lifeismeasuredbythoughtandaction,notbytime.——Lubbock衡量生命的尺度是思想和行為，而不是時間。8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:1011、Tomakealastingmarriagewehavetoovercomeself-centeredness.要使婚姻長久，就需克服自我中心意識。Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/202012、Treatotherpeopleasyouhopetheywil