木本觀賞植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

木本觀賞植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

植物組織培養(yǎng)是指對(duì)植物器官（根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等）進(jìn)行人工制備的培養(yǎng)基，并給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，以完成完整植物的過(guò)程。廣義的組織培養(yǎng)包括器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等;狹義的組織培養(yǎng)是指植物離體組織再生快繁技術(shù)即微型繁殖(Micro-propagation)或試管繁殖技術(shù)。1種針葉樹(shù)種的誘導(dǎo)染色體胚發(fā)生和再生技術(shù)植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞的全能性。1902年,德國(guó)植物學(xué)家GottliebHaberlandt提出了離體細(xì)胞培養(yǎng)的概念,并首次將分離的完全分化的細(xì)胞進(jìn)行了組織培養(yǎng)試驗(yàn)。之后Skoog和Miller提出了激素控制器官形成的概念,使植物組織培養(yǎng)再生體系建立的研究達(dá)到了一個(gè)新水平。目前植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用和研究主要涉及到花卉、藥用植物、農(nóng)林蔬菜等方面。木本植物由于普遍存在生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),體細(xì)胞中含有較多的多酚類物質(zhì)易導(dǎo)致植物材料褐化,短期經(jīng)濟(jì)效益較低,科研難度較大等現(xiàn)象,其組織培養(yǎng)研究相對(duì)較少。但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期探索,木本植物的組織培養(yǎng)技術(shù)也取得了一定成就。1934年法國(guó)學(xué)者Gautheret進(jìn)行的裸子植物組織培養(yǎng)研究,被認(rèn)為是木本植物組織培養(yǎng)研究的開(kāi)始。目前,楊柳科、薔薇科、木犀科、桑科、松科、杉科、鼠李科、大戟科、紫茉莉科、棕櫚科中的約近100種木本觀賞植物能夠?qū)崿F(xiàn)組培快繁,并有10余種已進(jìn)行大面積推廣,如杉木(Cunninghamialanceolata)、柳葉桉(Eucalyptussaligna)等。另外,約有20種針葉樹(shù)的外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚成功,如紅松(Pinuskoraiensis)、油松(P.tabulaeformis)及云南松(P.yunnanesis)等,在20余種闊葉樹(shù)種的組織培養(yǎng)中觀察到體細(xì)胞胚胎發(fā)生或獲得再生植株,如花楸樹(shù)(Sorbuspohuashanensis)已在實(shí)驗(yàn)室條件下完成了從未成熟和成熟合子胚中誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚,并再生出體胚苗;柑橘(Citrusreticulata)胚性細(xì)胞系的建立和體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)已較成熟。在胚乳培養(yǎng)方面,已能夠誘導(dǎo)出愈傷組織、胚狀體或已經(jīng)能夠分化出根,但只有10多種木本觀賞植物獲得了胚乳植株,如中華獼猴桃(Actinidiachinensis)、羅田甜柿(Diospyroskaki‘Luotian-tianshi’)等。能夠成功進(jìn)行原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的樹(shù)種達(dá)40多種,其中桑樹(shù)(Morusalba)、蘋果(Maluspumlia)、毛白楊(Populustomentosa)、白榆(Ulmuspumila)、二球懸鈴木(Platanushispanica)等10多種樹(shù)木已通過(guò)這種途徑建立了再生體系。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)建立植物再生體系,能夠極大地促進(jìn)木本觀賞植物品種改良和分子育種的發(fā)展。選擇合適的再生途徑對(duì)建立高效的木本觀賞植物再生體系十分重要,根據(jù)再生過(guò)程經(jīng)歷的途徑不同,木本觀賞植物的離體再生途徑大致可分為頂芽或腋芽途徑、不定芽途徑、胚狀體途徑、原球莖途徑。頂芽或腋芽途徑是木本植物組培快繁應(yīng)用最廣泛的方法,珙桐(Davidiainvolucrata)、銀杏(Ginkgobiloba)、胡桃(Juglansregia)、云南山茶(Camelliareticulata)、桑樹(shù)等很多木本觀賞植物都成功使用了該方法;在不定芽途徑中常用的外植體有莖尖、莖段(鱗莖、塊莖、匍匐莖)、花芽、葉、葉柄、根、花莖、萼片、花瓣、花托等,在木本觀賞植物中,報(bào)道使用這種方式繁殖成功的也較多,如翅果油樹(shù)(Elaeagnusmollis)、杜仲(Eucommiaulmoides)等;使用胚狀體途徑試驗(yàn)成功過(guò)的有蘇鐵(Cycasrevoluta)等;目前,原球莖途徑正處于試驗(yàn)研究階段,尚未見(jiàn)使用這種方式成功快繁木本植物的報(bào)道。在木本觀賞植物再生體系建立過(guò)程中,使用頂芽或腋芽途徑的多數(shù)經(jīng)過(guò)3個(gè)階段即可完成植株再生,依次為愈傷組織的啟動(dòng)、增殖與生根階段,如廣玉蘭(Magnoliagrandiflora)、麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)等;有些需經(jīng)過(guò)4個(gè)階段,即啟動(dòng)、增殖、壯苗、生根,如變?nèi)~木(Codiaeumvariegatum)、合歡(Albiziajulibrissin)等;少數(shù)將啟動(dòng)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)合二為一經(jīng)過(guò)2個(gè)階段即可完成,如臘梅(Chimonanthuspraecox)等。使用不定芽途徑或胚狀體途徑的一般經(jīng)過(guò)4個(gè)階段培養(yǎng)完成植株再生,如華北落葉松(Larixprincilis-ruppiechtii)等;也有經(jīng)過(guò)3個(gè)階段的,即將愈傷組織的誘導(dǎo)與分化合為一步,如雪柳(Fontanesiafortunei)等。各步驟之間無(wú)嚴(yán)格固定的界限,具體分法要根據(jù)具體要求和條件來(lái)確定。2快繁途徑的研究建立一個(gè)高效的木本觀賞植物快繁體系需要考慮的因素有很多,其中主要涉及合適的快繁途徑、外植體類型、基本培養(yǎng)基類型、激素和其他添加物的種類和配比、環(huán)境條件的控制等,近幾年的研究也主要圍繞在這方面。2.1外植體的選擇外植體類型是木本觀賞植物組織培養(yǎng)的重要影響因子之一。從理論上來(lái)說(shuō),植物的各個(gè)器官和組織均可用于組織培養(yǎng),但大量研究表明,樹(shù)木的不同組織或部位及其所處的發(fā)育階段或生理狀態(tài)在器官發(fā)生能力上有相當(dāng)大的差別。采集外植體時(shí)應(yīng)根據(jù)組培目標(biāo)和快繁途徑以及所用植物的生態(tài)習(xí)性選擇合適的外植體類型,一般選擇幼嫩的器官或組織,如莖尖、幼葉、胚、子葉、下胚軸等,也有適合用莖段、成熟葉片、根、髓、花器官等作為外植體的。楊禮香等對(duì)芽和莖段進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下,芽為外植體產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間早,誘導(dǎo)率高,且愈傷組織生長(zhǎng)速度快;蘋果組培研究表明,以葉片作外植體時(shí),以新梢頂端將展開(kāi)幼葉的植株再生能力最強(qiáng),葉片的中部比頂部或基部更易于再生植株,葉片近柄端愈傷組織發(fā)生較早;李慧等在銀白楊(Populusalba)葉片不定芽再生影響因素的研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)出芽時(shí)間和再生率自上而下依次遞減。2.2分離培養(yǎng)細(xì)胞的誘導(dǎo)組織培養(yǎng)中,植物材料附著在培養(yǎng)基上并且從中吸收所需要的各種物質(zhì),不同的培養(yǎng)基對(duì)有目的的組織培養(yǎng)非常重要。大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中均含有無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、碳源、有機(jī)添加物、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和膠凝劑。不同類型植物或者外植體適宜的培養(yǎng)基不同。章國(guó)瑛等的研究表明,在B5培養(yǎng)基上,莖段愈傷組織誘導(dǎo)率高于葉片,而在MS培養(yǎng)基上,葉片愈傷組織誘導(dǎo)率高于莖段。培養(yǎng)階段或者培養(yǎng)目標(biāo)不同,合適的培養(yǎng)基也不同,一般認(rèn)為較低的無(wú)機(jī)鹽濃度、高生長(zhǎng)素濃度和低細(xì)胞分裂素濃度利于生根,如毛葉棗(Zizyphusmauritiana)在啟動(dòng)和增殖階段使用MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)較好,但生根階段卻以1/2MS培養(yǎng)基為宜;誘導(dǎo)銀杏莖段愈傷組織最適宜的培養(yǎng)基為MS,分化芽的最適培養(yǎng)基為1/2MS,而誘導(dǎo)根卻在White培養(yǎng)基上。竹子在離體快繁的過(guò)程中更易見(jiàn)到試管苗開(kāi)花,這實(shí)際上是由于營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不全或不足時(shí)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)不正常而轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng),從而出現(xiàn)花芽分化導(dǎo)致開(kāi)花。此外培養(yǎng)基的存在狀態(tài)也能影響組培效果,如使用液體培養(yǎng)基更能促進(jìn)山茶花生根等。2.3外植體的誘導(dǎo)在植物組織培養(yǎng)中,外源激素的種類、質(zhì)量濃度和配比是最主要的因素之一。一般使用的激素有生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素、赤霉素類、脫落酸、乙烯、油菜素甾體類物質(zhì)等。木本觀賞植物組培中常用的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)有6-BA(6-芐基腺嘌呤)、KT(激動(dòng)素)、ZT(玉米素)、TDZ(噻重氮苯基脲)等。細(xì)胞分裂素對(duì)組培中不定芽的分化及增殖有著顯著的作用,其中6-BA使用最為廣泛,使用濃度范圍大多在0.05~3.00mg/L,但也有例外,如野生荔枝(Litchichinensisvar.euspontanea)的種子萌發(fā)培養(yǎng)基中6-BA的濃度達(dá)到了20mg/L。有些細(xì)胞分裂素對(duì)愈傷組織的形成也有明顯作用,如KT和6-BA,兩者的作用各有特點(diǎn),6-BA能促進(jìn)細(xì)胞分裂,有利于愈傷組織的形態(tài)建成;KT對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不大,但在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加適量的KT可改善愈傷組織的質(zhì)量。還有研究表明,對(duì)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生,TDZ在某些樹(shù)種中表現(xiàn)出了特別的效果,如0.002~0.050mg/L的TDZ可誘導(dǎo)花楸、刺槐(Robiniapseudoacacia)等植物形成大量的芽,誘導(dǎo)能力是6-BA的50~100倍。木本觀賞植物組培中常用的生長(zhǎng)素是2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)等。在誘導(dǎo)愈傷組織和誘導(dǎo)生根的時(shí)候往往以生長(zhǎng)素為主,大多數(shù)植物都能在添加2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織,但2,4-D有抑制芽形成的副作用,而且過(guò)量使用會(huì)產(chǎn)生毒害作用,因此在愈傷組織誘導(dǎo)階段,添加外源生長(zhǎng)素類時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮采用NAA、IAA,如兩者都不能完成愈傷組織誘導(dǎo)時(shí),再考慮采用2,4-D誘導(dǎo)。已有試驗(yàn)證明,適宜濃度的NAA可以替代2,4-D。在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí),一般還需要添加一定量的細(xì)胞分裂素,這樣可使得到的愈傷組織更具有胚性。大量研究表明,在培養(yǎng)過(guò)程中,有時(shí)候使用單一某種激素即有效果,如楊禮香等使用芽作為外植體時(shí),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加適宜濃度的2,4-D和NAA即可使愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%,說(shuō)明當(dāng)外植體細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)時(shí),只使用細(xì)胞生長(zhǎng)素也可誘導(dǎo)愈傷組織。但很多時(shí)候使用某一種激素的同時(shí),添加少量其他激素可取得更好的效果,如章國(guó)瑛等利用莖段作外植體,在B5培養(yǎng)基中添加NAA(3.0mg/L)和6-BA(0.1mg/L),使愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%。也有些植物必須使用2種或以上的激素才能夠起作用,如在含有BA的培養(yǎng)基中,檸條(Caraganakorshinkii)必須通過(guò)加入2,4-D才能形成愈傷組織,而花棒((Hedysarumscoparium)、羊柴(H.leave)需要再加入IAA來(lái)誘導(dǎo)形成愈傷組織。一般認(rèn)為,培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比值高時(shí),有利于根的分化或愈傷組織的形成,比值低時(shí),則利于芽的分化。但也有例外,如紫杉(Taxuscuspidata)莖尖能誘導(dǎo)出不定芽與不定根,但不定芽的形成與6-BA/IBA比值和母樹(shù)樹(shù)齡有關(guān),而不定根的形成主要取決于IBA的質(zhì)量濃度與母樹(shù)樹(shù)齡。2.4冬酰胺、谷氨酰胺、gane3、多效唑、活性炭、間苯三酚、激素、激素木本觀賞植物組織培養(yǎng)中,還經(jīng)常需要加入其他的有機(jī)物等外源添加物,如椰子乳、天冬酰胺、谷氨酰胺、CH(水解酪蛋白)和GA3(赤霉素)、AgNO3、PP333(多效唑)、活性炭、間苯三酚、核黃素、氯化膽堿、青霉素等。例如,在進(jìn)行壯苗培養(yǎng)時(shí)加入赤霉素可以促進(jìn)莖的伸長(zhǎng);在培養(yǎng)基中添加活性炭能夠提高生根苗的質(zhì)量。2.5暗期對(duì)蘋果生根培養(yǎng)的影響光照、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、繼代次數(shù)等環(huán)境因素也能明顯的影響組培效果。采用赤桉(Eucalyptuscamaldulensi)葉片誘導(dǎo)不定芽時(shí),先暗培養(yǎng)10d后再轉(zhuǎn)移到16h/d的光暗交替培養(yǎng)條件下,其不定芽的誘導(dǎo)率要高于全程光下培養(yǎng)的誘導(dǎo)率,但隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),不定芽誘導(dǎo)率會(huì)下降;蘋果進(jìn)行生根培養(yǎng)時(shí)往往需要先在根原基誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗條件下培養(yǎng)5~7d,根原基產(chǎn)生后再轉(zhuǎn)入不定根伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng);Kozai等研究了日平均溫度20℃下的3個(gè)不同溫差,即+10℃(光期25℃,暗期15℃)、0℃(光期20℃,暗期20℃)、-10℃(光期15℃,暗期25℃)變溫處理對(duì)組培苗的作用效果,結(jié)果表明苗體高度隨溫差的增大而增大,但苗的干重和鮮重不受溫差影響;很多植物在多次繼代后變異幾率可能會(huì)增加,而有些植物卻能長(zhǎng)期繼代,如月季等在多次繼代后仍能長(zhǎng)期繼代,且可保持原來(lái)的再生能力和增殖率;在檸檬桉的生根培養(yǎng)階段,需要繼代培養(yǎng)幾次后才能發(fā)根;月季等在移栽前需要在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間(無(wú)論生根與否),然后再移栽更易成活。3木本植物組織培訓(xùn)中常見(jiàn)的問(wèn)題和處理褐化、污染、玻璃化是木本觀賞植物組織培養(yǎng)再生體系建立過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題。3.1控制褐變的物質(zhì)木本植物體細(xì)胞內(nèi)含有較多的酚類化合物,當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時(shí),這些物質(zhì)相互接觸發(fā)生一系列酶促反應(yīng),形成有毒害的褐色物質(zhì),外植體隨之進(jìn)一步變褐死亡,這種現(xiàn)象稱為褐化。同時(shí),發(fā)生褐化的組織也會(huì)向培養(yǎng)基內(nèi)釋放褐色物質(zhì),以至危害到周圍的材料。在培養(yǎng)基中加入Vc可有效的防止褐化;蛋白水解產(chǎn)物、多胺等物質(zhì)也可作為抑制劑來(lái)防止褐變的發(fā)生。此外,選擇合適的消毒劑和消毒方法,適當(dāng)?shù)蜏?適當(dāng)降低培養(yǎng)基的pH,適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度,降低接種密度,縮短轉(zhuǎn)瓶周期等也可減輕褐化的發(fā)生和危害。還有不少研究表明光照也能影響褐化,但在不同植物種類中表現(xiàn)出的規(guī)律不同,甚至相反。同時(shí)還要注意,一些因素具有多重影響,如活性炭也能有防止褐化,但活性炭也能吸附培養(yǎng)基中的一些其他有機(jī)物,所以在加入活性炭的培養(yǎng)基中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整激素配比使其維持在適宜的水平。3.2表面活性劑的使用對(duì)于外植體本身帶菌,可針對(duì)外植體的選取和消毒2方面處理。對(duì)母株進(jìn)行預(yù)處理,采集外植體時(shí)盡量選取帶菌少的材料。給外植體消毒的時(shí)候,一般使用酒精和升汞結(jié)合的消毒方法,還有一些比較特殊的方法,如減壓滅菌法、臭氧消毒法、間隙消毒法、超聲波振動(dòng)滅菌等,另外,用多菌靈和青霉素的混合液處理污染程度較輕的月季(Rosachinensis)帶芽莖段也能獲得較好效果;沖洗外植體時(shí)或消毒時(shí)加入少量表面活性劑可提高去污和消毒殺菌效率;在培養(yǎng)基中加入適量抗生素等抗菌劑也有一定效果,但長(zhǎng)期使用可能會(huì)出現(xiàn)耐藥性。在實(shí)際操作中,往往綜合使用多種方法來(lái)達(dá)到最好的效果。在進(jìn)行接種操作時(shí)和培養(yǎng)過(guò)程中,為防止帶入微生物引起污染,需及時(shí)更換切割外植體時(shí)使用的無(wú)菌盤,使用2套鑷子和