轉(zhuǎn)基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展

轉(zhuǎn)基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展

大豆來自中國。它不僅是人類最重要的油資源和植物蛋白的來源，也是一個重要的工業(yè)材料。它在我國的糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。我國大豆種植受自然條件等逆境因子制約常造成減產(chǎn),同時大豆品種適種范圍窄,嚴(yán)重影響優(yōu)良品種的大面積種植。作物常規(guī)育種在提高產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性等方面發(fā)揮主導(dǎo)作用,但受有益突變效率和生殖隔離等特性制約,利用有限。而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)能把外源抗逆基因(轉(zhuǎn)錄因子)引入到作物中,可提高作物抗逆性,被動地提高作物產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因大豆與其他主要作物相比,遺傳轉(zhuǎn)化體系不夠穩(wěn)定,有待完善,轉(zhuǎn)化率有待提高。實(shí)現(xiàn)此目標(biāo),需要以下體系作支持:(1)良好的植株再生體系(受體系統(tǒng));(2)DNA導(dǎo)入到再生細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體系(轉(zhuǎn)化方法);(3)良好的篩選系統(tǒng)和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效率。國內(nèi)大豆生產(chǎn)與加工轉(zhuǎn)基因技術(shù)自主研發(fā)實(shí)力不足,存在轉(zhuǎn)化效率低,重復(fù)性差等問題,不少研究者針對不同的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn),以期提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率。1中國轉(zhuǎn)移大豆的種植現(xiàn)狀及研究1.1以抗草甘膦轉(zhuǎn)大豆為主要的轉(zhuǎn)基因作物國際農(nóng)業(yè)生技產(chǎn)業(yè)應(yīng)用服務(wù)中心(Internationalservicefortheacquisitionofagri-biotechapplications,ISAAA)資料顯示,1996年轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為170萬hm2,2011年已達(dá)到1.6億hm2,增長94倍,轉(zhuǎn)基因大豆作為主要的轉(zhuǎn)基因作物,占據(jù)全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的47%(7540萬hm2)。其中以抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(Roundupreadysoybean,RRS)種植為主。由于轉(zhuǎn)基因大豆帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益,種植規(guī)模逐年擴(kuò)大。近幾年,中國轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展迅速,主要是以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉為主,但轉(zhuǎn)基因大豆尚未進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)階段。1.2國內(nèi)外細(xì)胞轉(zhuǎn)化和基因轉(zhuǎn)換的進(jìn)展Hinchee首次報道成功獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株,抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(RR大豆)和高油酸大豆(HO大豆)在國際上的種植面積不斷增加,轉(zhuǎn)基因大豆類型不斷增加。我國研究者主要在大豆抗病蟲害、抗逆性及大豆油分等重要農(nóng)藝性狀方面獲得轉(zhuǎn)基因植株。徐香玲等將PKT54B7C5上的B、T、K-δ內(nèi)毒蛋白基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入大豆黑農(nóng)37、黑農(nóng)39等品種,獲得再生大豆植株,并且利用同樣的方法將抗真菌的幾丁酶基因?qū)氪蠖蛊贩N東農(nóng)37號、吉林28號等14個品種,得到轉(zhuǎn)化植株。尹青女等向大豆受體導(dǎo)入熱激轉(zhuǎn)錄因子8(Heatshockfactor8,hsf8)基因,以加強(qiáng)目的基因hsf70的表達(dá)和增加轉(zhuǎn)基因大豆的抗逆性。李小平等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法,共獲得3株轉(zhuǎn)基因植株。該植株RT-PCR分析表明,rlpk2基因已被成功敲減,并發(fā)現(xiàn)敲減大豆葉片中的rlpk2基因,明顯改善葉片的光合能力。張秀春等經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo),采用子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大豆,獲得一批攜帶有玻璃苣Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)基因大豆。國內(nèi)關(guān)于轉(zhuǎn)基因大豆的研究絕大多數(shù)都是對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗性標(biāo)記篩選、PCR檢測以及Southern雜交,僅證明外源基因已整合到大豆基因組中。與國內(nèi)相比,國外不僅具有自主知識產(chǎn)權(quán)的載體和像Bt和EPSP基因一樣具有重大應(yīng)用前景的基因,且基因轉(zhuǎn)化和篩選效率比國內(nèi)高。國外轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)業(yè)化引領(lǐng)世界轉(zhuǎn)基因作物的快速發(fā)展。如美國Monsanto公司利用基因槍轟擊方法將編碼5-烯醇-丙酮酸莽草酸-磷酸合成酶(EPSPS)基因轉(zhuǎn)入大豆,培育出RoundupReady轉(zhuǎn)基因大豆并大面積產(chǎn)業(yè)化。相同品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因大豆研究也取得重要進(jìn)展,如轉(zhuǎn)Δ12脂肪酸脫氫酶基因(FAD2-1)大豆,油酸含量達(dá)70%,并于1997年獲準(zhǔn)推廣;通過抑制大豆Δ12脂肪酸脫氫酶(FAD2)基因和ACP-棕櫚酸硫激酶(FatB)基因的表達(dá),減少種子中Δ12脂肪酸脫氫酶含量,同時控制棕櫚酸產(chǎn)量,從而實(shí)現(xiàn)富集油酸,獲得油酸含量高達(dá)85%的大豆新品系并己開始大規(guī)模種植。2制備好的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)大豆遺傳轉(zhuǎn)化依賴于高效受體系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化方法的有效結(jié)合,因此,建立良好的受體系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件,關(guān)系到基因轉(zhuǎn)化的成敗。一個良好的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)具備高效穩(wěn)定的再生能力、穩(wěn)定的可遺傳性、對選擇性抗生素敏感、對農(nóng)桿菌侵染有敏感性以及具有穩(wěn)定的外植體來源。自轉(zhuǎn)基因技術(shù)問世以來,研究者先后建立了許多受體系統(tǒng):(1)直接分化再生系統(tǒng);(2)體細(xì)胞胚受體系統(tǒng);(3)原生質(zhì)體再生系統(tǒng);(4)愈傷組織再生系統(tǒng);(5)生殖細(xì)胞再生受體系統(tǒng)。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,大豆再生受體系統(tǒng)包括直接分化再生系統(tǒng)和體細(xì)胞胚受體系統(tǒng)。2.1不同外植體的分離技術(shù)Cheng等首次報道無菌苗的子葉節(jié)為外植體,誘導(dǎo)叢生芽獲得高頻率的再生植株。此外,無菌苗莖尖,成熟胚子葉,幼胚軸以及下胚軸均可作為誘導(dǎo)再生植株的外植體。陳云召等從大豆下胚軸和小真葉離體培養(yǎng)成再生植株。薛仁鎬等培養(yǎng)幼胚、幼胚子葉、成熟子葉節(jié)、成熟子葉等再次從大豆下胚軸和小真葉離體培養(yǎng)成再生植株。不同的外植體再生頻率差異較大,其中子葉節(jié)的再生頻率較高;并且不同的大豆品種誘導(dǎo)分化芽的能力差別較大,選擇再生頻率高的基因型、外植體和培養(yǎng)基對大豆組織培養(yǎng)很重要。由于子葉節(jié)的再生頻率較高,目前常被作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的受體材料,它具有再生時間短、外植體容易獲得、不受季節(jié)限制、再生過程簡單、再生頻率高等優(yōu)點(diǎn),但運(yùn)用此法在切子葉節(jié)時需要精細(xì)的人工操作,且不定芽起源于多細(xì)胞,所形成的再生植株有較多的嵌合體,加大后代的篩選難度,同時子葉節(jié)受體系統(tǒng)還存在轉(zhuǎn)化效率較低等缺陷,使其應(yīng)用受到限制。Paz等通過改進(jìn)子葉節(jié)受體系統(tǒng),以半種子作為外植體,減少切子葉劃傷過程,不但簡化了試驗(yàn)流程,而且提高轉(zhuǎn)化效率(因品種不同轉(zhuǎn)化效率在1.4%~8.7%,平均為3.8%)。除子葉節(jié)受體系統(tǒng)外,直接分化再生系統(tǒng)還包括大豆胚軸和胚尖等受體系統(tǒng)。2.2大豆細(xì)胞胚的誘導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化受體材料中的細(xì)胞胚主要以未成熟胚的子葉為外植體,經(jīng)誘導(dǎo)后形成體細(xì)胞胚。Christionson等觀察到大豆細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時體細(xì)胞胚胎發(fā)生,以幼胚軸為外植體,首先獲得再生植株。隨后Ranch及Lazzeri等對2,4-D誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚進(jìn)行較為詳細(xì)的研究,發(fā)現(xiàn)2,4-D誘導(dǎo)大豆體細(xì)胞胚胎發(fā)生頻率高,但形態(tài)不正常,難以萌發(fā)形成完整植株。而NAA誘導(dǎo)的大豆體細(xì)胞胚胎發(fā)生頻率低,但形態(tài)正常,可不經(jīng)過愈傷組織而直接生成子葉期體細(xì)胞胚,說明不同植物激素對體細(xì)胞胚的形成及正常生長產(chǎn)生影響。Finer等對體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系進(jìn)行改進(jìn),用于遺傳轉(zhuǎn)化,使只有轉(zhuǎn)化部位細(xì)胞可以增殖,因而能進(jìn)行有效篩選,解決嵌合體問題。曲桂芹等通過研究大豆體細(xì)胞胚誘導(dǎo)因素發(fā)現(xiàn),除不同植物激素會對體細(xì)胞胚產(chǎn)生影響外,大豆基因型、生長素濃度、外植體大小、光周期及培養(yǎng)基中碳源等都對大豆體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)有顯著影響。體細(xì)胞胚胎是基因槍轉(zhuǎn)化較為理想的轉(zhuǎn)化受體,為目前大豆轉(zhuǎn)化適宜的受體再生體系。但是此系統(tǒng)再生頻率低,誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚畸形多,不能發(fā)育成正常植株,而且體細(xì)胞胚多次繼代增殖后,胚性喪失及體細(xì)胞變異等問題是影響其用于遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素,需要進(jìn)一步研究解決。2.3原生質(zhì)體再生植株的培養(yǎng)衛(wèi)志明等首次報道大豆原生質(zhì)體再生系統(tǒng),獲得愈傷組織并誘導(dǎo)成苗,得到再生植株。隨后,羅希明和Dhir等以相似方法獲得不同品種的大豆原生質(zhì)體再生植株。肖文言等經(jīng)大豆幼胚子葉原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。這些研究成果證明通過原生質(zhì)體獲得再生植株的途徑可行,可為大豆遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的研究提供依據(jù)。但由于原生質(zhì)體再生頻率較低、操作較為復(fù)雜、不同基因型差異很大、可重復(fù)性差以及原生質(zhì)體再生植株易發(fā)生變異現(xiàn)象等缺點(diǎn),近年來少有研究報道。3大豆加工方法及微模模式隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的日益擴(kuò)大,轉(zhuǎn)化技術(shù)在作物新品種培育、基因功能研究等領(lǐng)域中的作用越來越大,中國大豆轉(zhuǎn)基因所用的方法包括花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電擊法、超聲波法等。其中前兩種方法應(yīng)用較多,后幾種方法應(yīng)用較少。國外大豆的轉(zhuǎn)基因方法主要以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法為主;國內(nèi)主要是超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是獲得第一個轉(zhuǎn)基因植物的方法,迄今為止,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因植物占轉(zhuǎn)基因植物總數(shù)85%,已成為植物基因轉(zhuǎn)化首選方法。3.1農(nóng)桿菌誘導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是指農(nóng)桿菌侵染植物時,受到植物受傷后釋放的酚類物質(zhì)的刺激,活化質(zhì)粒上Vir區(qū)基因的表達(dá),將質(zhì)粒上的另一段DNA(T-DNA)共價整合到植物基因組上,在植物體內(nèi)表達(dá)而改變植物的遺傳特性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率受眾多因素影響,如農(nóng)桿菌侵染外植體的影響因素、外植體再生能力的內(nèi)在因素和環(huán)境條件(pH、溫度和光照條件)等,此法具有流程簡單、儀器設(shè)備便宜、拷貝數(shù)低,且基因沉默少,轉(zhuǎn)移的基因片段長等優(yōu)點(diǎn)。在大豆中,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最早、最常用的方法。Hinchee等第一次利用大豆葉盤,獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株,以子葉節(jié)、成熟種子、胚尖和葉柄等獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株。近年來,研究者通過各種嘗試對農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行改良,如輔助試劑的加入,包括乙酰丁香酮、DTT等硫醇類化合物,以及表面活性劑、AgNO3、bar基因的使用及篩選策略的改變,超聲波、針簇和刷子等輔助技術(shù)的使用,目前轉(zhuǎn)化效率達(dá)3%以上,但各實(shí)驗(yàn)室間的轉(zhuǎn)化效率存在較大差異。農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)受到多種因素影響,對其影響因素深入研究,有利于提高轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化效率,實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化和改良。首先是對受體基因型篩選,受體材料不僅必須具有農(nóng)桿菌易感染性,還需有良好的再生能力。在大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究中,研究人員篩選出一些適于轉(zhuǎn)化的大面積推廣品種。其次是外植體的選擇,子葉節(jié)、體細(xì)胞胚、胚尖分生組織、器官愈傷組織等可作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,針對不同外植體的轉(zhuǎn)化弱點(diǎn)加以改進(jìn),如降低子葉節(jié)方法再生植株中嵌合體比例。體系胞胚為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法雖然可以解決嵌合體比例高的問題,但其受基因型和取材季節(jié)限制較大,因此有必要大量篩選出適合該方法的大豆基因型。3.2基因槍誘導(dǎo)法基因槍法又稱微彈轟擊法,是將外源基因包裹在直徑1~2nm的鎢或金顆粒表面,加速轟擊植物外植體靶組織,穿過植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而將外源基因帶入植物細(xì)胞。因此,通過該方法進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)移過程不受外植體基因型的限制,可以將外源基因轉(zhuǎn)移至幾乎所有的植物細(xì)胞、組織器官和原生質(zhì)體中?；驑尳閷?dǎo)法在小麥中應(yīng)用最多,其次是玉米和水稻。優(yōu)點(diǎn)是不受外植體范圍的限制,且載體構(gòu)建相對簡單,但基因槍介導(dǎo)法存在轉(zhuǎn)化效率低、外源DNA片段大小不明確、多拷貝整合比較多、容易發(fā)生基因沉默現(xiàn)象等缺點(diǎn),不利于外源基因在宿主中的穩(wěn)定表達(dá),而且成本高,操作比較復(fù)雜,在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性。莖尖分生組織是大豆中利用此法首次報道的外植體,Mccabe等利用外源DNA包被的鎢粉粒轟擊大豆莖尖分生組織,獲得轉(zhuǎn)基因大豆。體細(xì)胞胚系統(tǒng)成為主要的受體系統(tǒng),利用基因槍介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)基因報道不斷出現(xiàn)。Rech等用無菌水浸泡大豆成熟種子16h獲得大豆胚尖,以此作為外植體,利用基因槍介導(dǎo)法進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化,其平均轉(zhuǎn)化效率高達(dá)9%,是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率最高的研究報道。3.3采用花粉管法轉(zhuǎn)化大豆其他方法由于或多或少存在缺陷,其研究者把目光投向沒有篩選基因的轉(zhuǎn)化方法。此外,Liu等利用花粉管法直接把DNA導(dǎo)入到大豆基因組中,獲得轉(zhuǎn)基因大豆,其轉(zhuǎn)化效率為3.2%。由于此法將DNA直接導(dǎo)入,而不需要報告基因,目的基因轉(zhuǎn)入也不需要在載體上,因此,不會帶入多余的載體骨架,環(huán)境安全性好。4抗錯誤基因的篩選為提高大豆轉(zhuǎn)化率,獲得非嵌合體轉(zhuǎn)基因植株,采用一定的篩選策略是植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中的一個關(guān)鍵步驟。常用的篩選策略有抗性基因的使用、具有表型或生理篩選功能基因(如亞硝酸還原酶NIR基因的應(yīng)用)和PCR篩選。由于抗性基因的篩選策略可使轉(zhuǎn)基因組織獲得競爭優(yōu)勢,降低非轉(zhuǎn)化體的逃逸率、減少嵌合體的形成、提高再生植株的陽性率,因此使用最為廣泛。目前,在大豆用于抗性篩選的基因主要有編碼抗生素抗性基因和編碼除草劑抗性基因兩類。前者包括卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶nptⅡ)、潮霉素抗性基因(hpt)和壯觀霉素抗性基因(aada)。后者包括草甘膦抗性基因(epsps)、草丁膦抗性基因(bar)、乙酰輔酶抑制抗性基因(ahas)、ALS以及a-tubulin突變基因。除以上兩類常用的抗性篩選基因外,在大豆發(fā)根中還有利用氨基酸合成酶反饋抑制突變體基因(ASA2)作為選擇標(biāo)記基因。bar基因選擇策略的使用是大豆遺傳轉(zhuǎn)化過程的進(jìn)步。bar基因編碼草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(Phosphinothricinacetyltransferase,PAT),能使草胺膦(Phosphinothricin,PPT)轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴２莅缝?從而使草丁膦代謝失活。屬降解除草劑類系統(tǒng),對除草劑專一性強(qiáng),效率高,且對大豆本身生長負(fù)效應(yīng)小,是目前大豆篩選策略中的主流形式。Zhang等通過比較不同濃度草丁膦對大豆轉(zhuǎn)化過程中不同階段的影響,發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)階段使用5mg·L