5-fu與hsa的相互作用研究

5-fu與hsa的相互作用研究

氟尿酮屬于最初的磺酸鹽。其中，5-氟尿酮（5-fu）具有很強的水位腫瘤活性結構，以及易引起突變的烯醇結構。它可以干擾、阻止dna、鈉胺和蛋白質合成并發(fā)揮腫瘤作用。它是評價生命系統(tǒng)的重要內(nèi)容。生物大分子與植物小分子相互作用的研究是生命系統(tǒng)科學研究的重要內(nèi)容。本文論述了生物大分子與植物小分子相互作用的性質。以及藥物在分子水平上的作用。對于了解藥物的一般含義以及藥物治療效果的生命過程具有基礎和重要意義。根據(jù)藥物腫瘤機的研究，一些抗腫瘤藥物與d'特定相互作用是腫瘤活性的主要原因，而d'不是腫瘤藥物的唯一目標。腫瘤藥物和蛋白質的異質化變化也是腫瘤細胞去世機制的研究目的、內(nèi)容和方法。同時，還提供了各種疾病的相關研究信息，以確定藥物在人類血漿中的最佳濃度。微熱法的非特異性有助于研究藥物和生物高官之間的特定相互作用。采用圓二色譜法和楊氏計算方法，對溶液中的蛋白質結構變化進行了方便、有效、準確的分析。這是基于等溫反應和等溫反應的理論。利用最小熱反應法和太陽二色譜法，研究了藥物作為模型物質的異質化反應信息。以及以金屬或表面活性劑的分子之間的相互作用。因此，對于藥物和hsa的組合，我們可以獲得許多生命系統(tǒng)發(fā)展過程中的結構和能量變化信息，以及藥物代謝動力學和最佳藥物濃度的確定具有一定的理論和應用價值。微熱法的非特異性有助于研究藥物和生物高官之間的特定相互作用。這種二色譜分析方法也具有一定的操作價值。微熱法的非特異性有助于研究藥物和生物高官之間的特定相互作用。通過對溶液中蛋白質結構變化的分析，采用了最小差分離心法和楊氏計算方法。根據(jù)盡可能假設的假設和朗姆-色度-平面效應的測量，采用非線性最小差分法和楊氏計算方法，確定藥物配合體（5-fu）與蛋白質（hsa）的結合類型、單位點的組合，以及水體的密度、熵的變化、吉布斯自由裁量權和5-fu誘導的二級結構單元的相對含量。本文在力學原理和。1實驗部分1.1方法的精密度和試劑納瓦級滴定式微量熱計(TAM2277,瑞典ThermometricAB公司).用隨機所帶Digitam4.1軟件控制實驗過程并進行數(shù)據(jù)采集和處理.通過測定蔗糖稀釋焓驗證,該量熱計的電標定精密度高于±1%.JascoJ-810圓二色譜儀(Japan).人血清白蛋白(HSA),摩爾質量為66.5×103kg·mol-1,購自Sigma公司,其溶液濃度用稱重法配制.5-氟尿嘧啶(5-FU)(結構見圖1),購自北京百靈威化學技術有限公司.三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)、鹽酸、氯化鈉等均為分析純試劑,實驗用水是在堿性高錳酸鉀存在下制備的二次蒸餾水.5-氟尿嘧啶和HSA的溶液均用濃度為0.01mol·dm-3,pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制.1.25u3000酸、堿分別滴定氟尿炔啶和hsa的反應將5-氟尿嘧啶溶液裝入500μLHamilton注射器,用612LundSyringePump注射泵,每次滴12.00μL于0.50mLHSA溶液中.滴定時間間隔足夠長(40min),以使信號返回基線.安瓿中攪拌器轉速固定在30r·min-1,待基線在攪拌下穩(wěn)定后啟動實驗,以使攪拌產(chǎn)生的熱量被自動扣除.實驗溫度為(298.15±0.01)K.為扣除5-氟尿嘧啶和HSA的稀釋熱,分別進行5-氟尿嘧啶溶液向緩沖溶液中滴定和緩沖溶液向HSA溶液中滴定的實驗.1.35hsa結構參數(shù)測量HSA是光學活性物質,因此可通過圓二色譜(CD)分析溶液中藥物誘導HSA的構象改變.實驗時光源系統(tǒng)用氮氣保護(流量為5L·min-1),樣品池的光徑為0.1cm.測量參數(shù):掃描速率100nm·min-1,分辨率0.1nm,響應時間1s,累積次數(shù)3次.掃描波段為200~250nm,HSA原始濃度為2μmol·L-1.向上述指定濃度HSA中分別加入不同量的5-氟尿嘧啶,控制5-氟尿嘧啶與HSA摩爾比率Mr(c5-FU/cHSA)分別為0,71和140.用JascoJ-810圓二色譜儀(Japan)測其CD譜,并用該儀器附帶的楊氏方法軟件計算出本結合體系兩類作用位點對應HSA二級結構單元的相對含量.2結果與討論2.1配合體的力學性質對于藥物配體5-氟尿嘧啶與蛋白質(HSA)的結合過程,其基本假設為:(1)一個蛋白質分子可有i類結合位點,它們可結合相同的配體,同類中的所有位點在熱力學意義上是相同的;(2)i類結合位點相互獨立,即蛋白質分子的每一類受體位點與藥物配體的結合率彼此互不依賴.基于上述假設和Langmuir結合理論有式中θi,Ki和Ni分別是第i類位點的結合率、結合常數(shù)和結合位點數(shù)(或曰藥物配體5-FU與HSA結合的摩爾比率Mr=c5-FU/cHSA),cL,0和cP,0分別為配體和蛋白質的初始濃度,cL是配體的游離濃度.將(1)式代入(2)式有ITC實驗中第j次注射所得到的熱量(Qj)可表示為式中Vcell是微量熱計中安瓿(反應器)中被滴定劑的體積,?θi是從第j-1次注射到第j次注射第i類結合位點結合率的增量,?Hi是第i類位點的結合焓.由(3)式可知,在cL,0和cP,0已知的情況下,cL是關于Ni和Ki的函數(shù).所以(4)式含有Ki,?Hi,Ni共3m個未知量,根據(jù)等溫滴定量熱數(shù)據(jù)(Qj),利用MATLAB7.01軟件以Qj對cL,0進行非線性最小方差擬合,可得到3m個熱力學參數(shù).通過擬合曲線與實驗點的擬合度的回歸分析,當藥物配體與HSA結合時,在蛋白質HSA分子上有兩類結合位點(m=2,方差最小)是合理的[14~16](見圖3).因此,通過非線性擬合處理可確定本結合體系兩類結合的K1,K2,?H1,?H2,N1和N2六個熱力學參數(shù)值.根據(jù)熱力學原理,又可求出該結合過程體系的吉布斯自由能變和熵變(見表1).2.2類結合體系的擬合分析由圖2可見,隨藥物與HAS物質的量比Mr增加,藥物5-氟尿嘧啶與HSA的表觀摩爾結合焓(累積熱量與藥物的物質的量比)的變化呈現(xiàn)為先增加后減小(此趨勢轉化時5-氟尿嘧啶與HSA的物質的量比Mr約為73左右)然后趨于平穩(wěn)(此趨勢轉化時5-氟尿嘧啶與HSA的物質的量比Mr約為143左右).由圖3擬合曲線可看出,通過實驗預測的兩類結合位點的物質的量比Mr與應用非線性最小方差擬合方法(擬合曲線見圖3)確定的兩類結合的結合位點數(shù)分別為71和140是基本吻合的,這說明本文藥物與HSA結合作用的假設是可行的.由表1可見兩類結合體系的K值均相對較大,說明其結合力較強結合狀態(tài)亦較為穩(wěn)定.2.3民機菌細胞重疊過程多肽鏈和水化層相互作用的力學性質應注意做到三基本結合體系藥物與蛋白質的結合可設想涉及以下過程:a.藥物和蛋白質的溶解稀釋;b.蛋白質與單個藥物分子的作用;c.蛋白質在兩類作用位點與藥物配體的穩(wěn)定結合作用;d.藥物誘導蛋白質發(fā)生的構象變化.因為在ICT實驗中我們已經(jīng)設法扣除了藥物與蛋白質的溶解稀釋熱效應,又因為形成穩(wěn)定兩類作用位點時自由藥物分子的濃度遠低于量熱滴定實驗過程中樣品池內(nèi)藥物分子的濃度,所以a,b過程的熱效應可忽略不計.因此可以認為,本結合體系的熱效應主要是藥物配體與蛋白質分子的穩(wěn)定結合及其誘導產(chǎn)生的蛋白質分子的構象變化(即c,d過程)而產(chǎn)生的.蛋白質分子構象是其生物功能的基礎.藥物分子可通過調(diào)節(jié)蛋白質的構象變化發(fā)揮其藥理藥效作用.根據(jù)圓二色譜分析的研究結果(見表2、圖4)可以看出,本結合體系中蛋白質(HSA)的二級結構單元的相對含量是不同的,這說明伴隨著本結合體系兩類結合位點的形成,不同濃度的藥物配體與蛋白質的相互作用誘導蛋白質分子構象發(fā)生了一定程度的變化.根據(jù)蛋白質折疊熱力學原理,蛋白質的折疊過程是以自由能(?G)達最低趨勢由其伸展態(tài)(或曰去折疊,Unfolding)向其折疊態(tài)(Folding)演變的過程,蛋白質的構象變化及穩(wěn)定結構的形成是其發(fā)生折疊的結果.蛋白質折疊的熱力學基礎可表示為?G=GF-GU=?H-T?S=?H鏈+?H溶劑-T?S鏈-T?S溶劑,折疊過程的發(fā)生取決于蛋白質多肽鏈和溶劑的焓變(?H)和熵變(?S).?H鏈取決于折疊過程中蛋白質各殘基之間及其與溶劑之間的相互作用,?S鏈取決于蛋白質多肽鏈發(fā)生折疊的構象變化而?H溶劑和?S溶劑則取決于結合體系中諸種相互作用對溶劑水分子的分布和結構的影響.本結合過程的發(fā)生及其結合體系熱力學性質的改變是體系作用物質諸種相互作用效應綜合平衡的結果在結合過程中:(1)藥物和蛋白質分子表面的極性基團對溶劑水化層結構的破壞,因折疊過程中蛋白質折疊態(tài)非極性疏水側鏈之間的范德華作用(或稱分散效應dispersioneffect)不足于抵償?shù)鞍踪|伸展態(tài)極性水分子誘導疏水基團中的偶極而產(chǎn)生的靜電相互作用(或稱誘導效應inductiveeffect)而導致的蛋白質疏水鏈的折疊效應(?H非極性鏈),以及蛋白質分子表面極性側鏈之間相互作用的效應(?H極性鏈),為吸熱效應;(2)藥物與蛋白分子表面的極性基團之間的靜電相互作用以及氫鍵作用,蛋白質折疊態(tài)眾多水分子之間的氫鍵相互作用對伸展態(tài)水分子與疏水側鏈的相互作用的取代效應(?H溶劑),以及因藥物和蛋白質的極性基團與溶劑水分子的相互作用而導致的溶劑水分子在極性基團周圍一定程度的聚集分布效應(?H溶劑),為放熱效應;(3)折疊態(tài)稱之為“有序、堅密之構造”,伸展態(tài)稱之為“無序、散漫之構造”,折疊過程多肽鏈的?S鏈(構象熵變)<0,為熵減效應;因蛋白質(HSA)折疊過程中非極性側鏈疏水作用形成疏水核心導致伸展態(tài)非極性側鏈強迫溶劑水分子形成的剛性有序結構(或曰籠結構,clathratestructure)的破壞,致使部分溶劑水分子遷出疏水核心進入溶液本體轉化為自由水分子而產(chǎn)生的較大?S溶劑(疏水熵變)>0,為熵增效應;按照溶劑化分層結構理論處于原水化層與溶液本體之間的次水化層是活動性很大的無序排列的結構破壞區(qū)域,體系適量的極性基團對溶劑次水化層結構的影響,冰山四面體結構適量增加致使溶劑的?S溶劑(結構熵變)>0,亦為熵增效應.?S鏈(構象熵變)和?S溶劑(結構熵變)與?S溶劑(疏水熵變)相比,數(shù)值一般較小.能對蛋白質折疊形成穩(wěn)定構象作出單項較大貢獻的當屬非極性疏水側鏈引起的?S溶劑(疏水熵變).體系的焓變和熵變的改變特征是分析結合過程驅動及其作用推動力的熱力學依據(jù).根據(jù)Ross和Subramanian的觀點和本結合體系的熱力學性質的改變,可認為:第一類結合,?H>0(吸熱),?S>0(熵增)T?S>?H,熵增效應較大并決定該過程的?G<0,故表現(xiàn)為熵驅動過程,疏水相互作用可能是熵驅動的主要推動力;第二類結合,?H<0(放熱),?S>0(熵增),|?H|>|T?S|,放熱和熵增效應均導致該過程的?G<0,故表現(xiàn)為以焓驅動為主的焓-熵協(xié)同驅動過程,氫鍵和靜電相互作用可能是焓-熵協(xié)同驅動的主要推動力.對于本結合體系的熱效應,綜合結合過程中的吸熱效應和放熱效應,前者較大導致結合焓?H>0,后者較大導致結合焓?H<0.第一類結合的熵變?S>0,正值較大,為體系熵變因素中?S溶劑(疏水熵變)占有較大分額所致.第二類結合的熵變?S>0,數(shù)值較小,可能是伴隨著兩類作用位點的形成,游離藥物分子的減少,蛋白質疏水核心的基本穩(wěn)定,疏水作用的相對減弱,?S溶劑(疏水熵變)的降低而?S溶劑(結構熵變)和多肽鏈的?S鏈(構象熵變)作用的相對增大,熵變因素的