酮康唑?qū)π∈蟾螕p傷的保護作用

酮康唑?qū)π∈蟾螕p傷的保護作用

可卡因（cac）是國際上相對猖獗的藥物，其濫用已成為一個國際問題。作為濫用的毒品,可卡因在20世紀90年代流入我國,已有中毒死亡的報道?？梢?可卡因的走私和濫用問題必須引起足夠的重視。有關(guān)可卡因毒性的報道主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng),然而,越來越多的臨床證據(jù)表明,肝臟也是可卡因毒性的一個靶器官。濫用可卡因往往會導(dǎo)致肝功能異常,使肝臟無法發(fā)揮正常的生理功能。因此,開發(fā)能夠拮抗可卡因所致肝臟損傷的藥物就顯得尤為重要。有報道指出酮康唑(ketoconazole,KT)能夠改善可卡因?qū)Υ笫笮袨榈挠绊憽Ｈ欢?在許多臨床報告和回顧性研究中,也偶有酮康唑?qū)е碌幕瘜W(xué)性肝損傷的報道。從藥物安全性的角度考慮,應(yīng)該了解酮康唑?qū)煽ㄒ蛩碌母螕p傷方面有何相互影響,也就是研究兩種藥物之間的相互作用規(guī)律,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。本研究通過動物實驗研究酮康唑?qū)Ω闻K損傷的保護作用,并對藥物的作用機制進行初步的探索。1材料和方法1.1還原型谷胱甘肽、gsh和n-乙基順丁烯二酰亞胺KT,批號為20031207,南京白敬宇制藥廠提供,用時以0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulosesodium,CMC-Na)配成新鮮溶液。Coc,批號20020501,青海制藥廠提供,用0.9%生理鹽水配制。還原型谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)和N-乙基順丁烯二酰亞胺(N-ethylmaleimide,NEMI),上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司出品;氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione,GSSG):北京紅星生化技術(shù)公司出品;鄰苯二甲醛(O-phthaldehyde,OPT),北京金龍化學(xué)試劑有限公司出品。HITACHI-7170A型全自動生化分析儀,Hitachi公司生產(chǎn);722光柵分光光度計,上海第三分析儀器廠提供。1.2給藥、治療及給藥動物的檢測ICR小鼠(清潔級),♂,體重23～28g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。采用預(yù)防性和治療性給藥兩種方法。在預(yù)防性給藥實驗中,將動物按體重隨機分為6組,即溶劑對照組(5%CMC-Na,ig,qd×4d)、可卡因組(5%CMC-Na,ig,qd×4d,于d4給完CMC-Na30min后給予Coc80mg·kg-1,sc)、3個酮康唑預(yù)防給藥組(KT12.5,25和50mg·kg-1,ig,qd×4d,于d4給完KT30min后給予Coc80mg·kg-1,sc)、酮康唑單獨給藥組(KT200mg·kg-1,qd×4d,ig),每組5只。在治療性給藥實驗中,動物被隨機分為5組,即溶劑對照組(5%CMC-Na,ig)、可卡因組(Coc80mg·kg-1,sc)、3個酮康唑治療給藥劑量組(Coc80mg·kg-1,sc,30min后給予KT50,100和200mg·kg-1,ig),每組5只。所有動物在最后處理完成24h后予以脫臼處死,收集血清用于谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamylpyrubictransaminaes,GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamyloxaloacetictransaminase,GOT)和乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)的檢測。觀察動物肝臟變化并記錄動物體重和肝臟重量,計算臟器系數(shù)(肝臟/體重),留出部分肝組織用于做光鏡HE病理切片進行病理觀察。其他組織冷凍到-80℃低溫冰箱用于生化分析。1.3谷胱甘肽與谷胱甘肽的配比使用7170A型自動生化分析儀分析血清GPT,GOT和LDH活性(由北京大學(xué)第三醫(yī)院測定)。用改良Hission方法分析谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)和氧化性谷胱甘肽(oxidizedglutathione,GSSG)的含量,并計算兩者的比值(GSH/GSSG);肝臟中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量用TAB反應(yīng)法檢測。1.4組織病理學(xué)分析部分肝組織用甲醛固定,進行常規(guī)石蠟包埋切片,經(jīng)蘇木素和伊紅(HE)染色后在光鏡觀察病理改變。1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示。采用SPSS10.0軟件,分別按數(shù)據(jù)情況經(jīng)假設(shè)條件檢驗進行了方差齊性檢驗、方差分析、回歸分析和成組資料t檢驗處理等。2結(jié)果2.1對肝臟重量的影響由表1結(jié)果顯示,可卡因模型組小鼠體重、肝臟重量均顯著低于溶劑對照組;酮康唑各組與可卡因組相比,體重、肝臟重量略有增加,但無顯著性差異。肝體比各組之間未見差異。2.2酮康唑?qū)ρ迕富钚缘挠绊憜为毥o予可卡因后,血清酶的活性明顯升高。與可卡因組比較,酮康唑給藥組酶的活性均有有明顯的下降,50mg·kg-1組血清酶活性已經(jīng)接近正常水平(圖1)。3可卡因所致肝臟損傷的機制本次研究成功建立了可卡因所致的小鼠肝臟損傷模型。表現(xiàn)在體重的明顯下降和血清中GPT,GOT和LDH活性的急劇升高,肝臟出現(xiàn)明顯的病理變化。提示可卡因可以引起急性的嚴重的肝臟損傷。本次實驗還觀察到,可卡因能夠?qū)π∈蟾闻K造成氧化損傷。表現(xiàn)在小鼠肝臟MDA含量的升高和GSH/GSSG的顯著降低(P<0.01)。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,其含量的高低可反應(yīng)膜脂質(zhì)過氧化程度的強弱和細胞損傷的程度。谷胱甘肽是組織中重要的非蛋白質(zhì)巰基化合物,有還原態(tài)GSH和氧化態(tài)GSSG兩種形式。GSH是體內(nèi)強有力的自由基清除劑,可清除組織中過多的H2O2,ROOH等。在機體受到外源化合物的攻擊時,GSH能夠和外源物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),保持細胞和細胞器膜結(jié)構(gòu)的完整性,在肝臟的解毒方面起著非常重要的作用。GSH/GSSG的顯著降低反映出GSH的耗竭和不足,結(jié)果使細胞對毒物更敏感。通過這次實驗,可以證實酮康唑?qū)煽ㄒ蛩碌母闻K損傷具有保護作用。無論是預(yù)防性還是治療性給藥,與可卡因組比較,體重和肝重均有升高,血清酶和肝臟的病理表現(xiàn)也更接近正常水平。而單獨給予酮康唑亦未顯示肝臟損傷。而且從肝臟GSH/GSSG比值和MDA含量的變化中,可以看到酮康唑能夠?qū)箍煽ㄒ蛩碌难趸瘬p傷。目前,對于酮康唑的保護機制和其抗氧化損傷的環(huán)節(jié)尚不是很清楚,可能與以下因素有關(guān):①作為細胞色素酶P450強有力的抑制劑,酮康唑能夠阻止過氧化植烷酸α-氧化為降植烷酸,而后者在參與了細胞色素P450單氧酶系統(tǒng)的氧化過程。而這個系統(tǒng)在可卡因致肝損傷的機制中起了重要的作用。②作為一種抗炎性物質(zhì),酮康唑能夠促進前列腺素E2的合成,而減少血栓烷A2的生成,后者可以造成肝臟的炎性損傷。③酮康唑能夠抑制以大鼠肝微粒體或牛腦磷脂為底物的Fe3+-抗壞血酸依賴的脂質(zhì)過氧化過程。而且它能夠抑制Fe3+-ADP/NADPH系統(tǒng)誘導(dǎo)的微粒體過氧化作用。④酮康唑能夠影響鼠巨噬細胞J774系NO合酶的基因表達。而iNOS的減少將最終抑制自由基NO的釋放,進而阻止NO介導(dǎo)的可卡因所致的成年雄性小鼠的肝臟損傷。2.3gsh/gssg比值對mda含量的影響從表2結(jié)果可見,與溶劑對照比較,可卡因可以使肝臟中GSH/GSSG比值降低,MDA含量升高。而預(yù)防性給予酮康唑組,與可卡因組相比,GSH/GSSG比值升高,MDA含量降低。2.4肝胰腺組織病理反應(yīng)肉眼可見可卡因模型組的肝臟呈黃色的顆粒狀病變。光鏡下可見肝小葉中心出現(xiàn)大小不等的肝細胞變性和壞死區(qū)域,肝細胞大小發(fā)生變化,有些肝細胞呈水腫和空泡樣變性(圖2B)。與之相比,酮康唑預(yù)防給藥組(12.5mg·kg-1)有很明顯的改善(圖2C)。50mg·kg-1給藥組的肝臟的病理表現(xiàn)基本接近溶劑對照組的正常病理表現(xiàn)(圖2D和圖2A)。酮康唑單獨給藥組(200mg·kg-1)肝臟病理改變亦接近正常(圖2F)。2.5不同給藥劑量對肝重和卡因的影響表3結(jié)果顯示,與溶劑對照組相比,其余各實驗組動物的體重和肝重都有所下降,其中,可卡因組的變化具有顯著性差異。與單純給予可卡因的陽性組比較,給予酮康唑的治療組的體重有所升高,但是未發(fā)現(xiàn)顯著性變化。與可卡因組比較,200mg·kg-1給藥組肝重的升高具有顯著性。肝體比各組之間未見顯著性差異。2.6以一種治療為基礎(chǔ)的酮康唑酮活性物質(zhì)、got和ldh的影響可卡因組