五靈膠囊對(duì)小鼠免疫性肝損傷的影響

五靈膠囊對(duì)小鼠免疫性肝損傷的影響

0靈膠囊對(duì)抗體肝損傷的誘導(dǎo)根據(jù)最近的研究，肝臟損傷的發(fā)生和發(fā)展與mct密切相關(guān)。在炎癥因素的影響下，肝組織中的炎性細(xì)胞與kubu充分考慮后，它們激活并轉(zhuǎn)化了過(guò)敏。過(guò)敏后，細(xì)胞生成細(xì)胞因子，誘導(dǎo)化學(xué)性肝損傷和革蘭氏損傷。脂肪（lps）是tnf和其他因素的激活劑。當(dāng)卡介苗（bcg）存在時(shí)，它誘導(dǎo)著肝損傷。我們觀察了五種精神膠囊對(duì)肝臟損傷的影響。1材料和方法1.1供試液和試劑五靈膠囊由西京醫(yī)院中藥制劑室提供,批號(hào):990430;環(huán)磷酰胺(連云港恒瑞制藥有限公司)批號(hào):981225;一氧化氮測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所提供;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT),北京中生公司提供;卡介苗(BCG)衛(wèi)生部成都生物制品研究所提供,取1支(10人份)用溶劑2mL溶解作為供試液;LPS,Sigma公司產(chǎn)品;纖維結(jié)合蛋白(Fn)、TNF單抗由本校免疫教研室提供,二抗BDAKO公司產(chǎn)品,BALB/c小鼠由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物證號(hào):陜醫(yī)動(dòng)證字08-013號(hào).1.2組織病理學(xué)檢測(cè)小鼠隨機(jī)分成5組,即正常組、模型組、環(huán)磷酰胺組、五靈膠囊兩組,每組10只.置室溫(22±3)℃、濕度60%～75%實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境3d后試驗(yàn),試驗(yàn)之日除正常組外,余組小鼠尾靜脈注射BCG供試液0.1mL/只,次日正常和對(duì)照組ig生理鹽水10mL·kg-1,環(huán)磷酰胺組ip環(huán)磷酰胺30mg·kg-1,五靈膠囊兩組分別ig2g·kg-1和1g·kg-1,各組小鼠連續(xù)給藥12d,末次給藥后小鼠尾靜脈注射LPS90μg/只,12h后小鼠眼眶取血,離心,取血清測(cè)定AST,ALT.同時(shí)取肝大葉0.8g,用冰冷生理鹽水沖去表面血漬置勻漿器中在冰浴中碾勻,置低溫高速離心12298g·min-1,離心30min,取上清液3mL,加入88mmol·L-1氯化鈣0.3mL,充分搖勻,4℃靜置15min,取出,19216g·min-1,離心40min,棄去上清,沉淀加0.3mol·L-1磷酸緩沖液1mL溶解,作為肝組織供試品液,取供試品液0.5mL按硝酸還原酶法測(cè)定供試品液中的NO,所測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)SPLM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.取各組小鼠肝組織,用0.015mol·L-1磷酸緩沖液配成100mL·L-1甲醛固定液固定,石蠟包埋,切片,按文獻(xiàn)改良后進(jìn)行免疫組化染色,常規(guī)脫蠟至水,PBS洗滌3次每次5min,末次PBS液中加入300mL·L-1雙氧水3mL,封閉30min,PBS再洗滌3次每次5min,5g·L-1胃蛋白酶消化20min,PBS洗滌3次每次5min,加入TNF,FN一抗4℃冰箱放置48h,37℃復(fù)溫1h,PBS洗滌3次每次5min,加入二抗37℃放置40min,PBS洗滌3次每次5min,DAB顯色5～15min,鏡觀終止反應(yīng),蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán),自來(lái)水沖洗,常規(guī)脫水.2結(jié)果2.1小鼠血清ast,alt的變化情況對(duì)照組(模型組)小鼠血清AST,ALT顯著高于正常組(P<0.01)、環(huán)磷酰胺與五靈膠囊兩劑量組小鼠血清AST,ALT明顯低于對(duì)照組(P<0.01),對(duì)照組小鼠肝勻漿NO值明顯低于正常組(P<0.01),環(huán)磷酰胺組與五靈膠囊1g·kg-1組小鼠肝勻漿NO值與對(duì)照組相似,五靈膠囊2g·kg-1組小鼠肝勻漿NO值顯著高于前兩組,與正常組相似(Tab1).2.2不同途徑感染wppffer細(xì)胞tnf對(duì)照組小鼠肝小葉內(nèi)片狀與灶性壞死區(qū)TNF物質(zhì)呈弱陽(yáng)性,在壞死區(qū)與未損傷區(qū)邊界、感毒區(qū)內(nèi)TNF物質(zhì)呈強(qiáng)陽(yáng)性片狀分布,TNF物質(zhì)位于中央靜脈區(qū)與匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、Kupffer細(xì)胞周圍.Fn陽(yáng)性物質(zhì)位于受損肝細(xì)胞內(nèi)及Kupffer細(xì)胞周圍,三五成群地分布于小葉邊緣區(qū),肝小葉灶性與片狀壞死區(qū)域附近呈強(qiáng)陽(yáng)性分布,此外,肝竇壁及內(nèi)皮細(xì)胞也呈陽(yáng)性(線形樣).環(huán)磷酰胺組小鼠肝細(xì)胞TNF物質(zhì)呈弱陽(yáng)性,肝組織內(nèi)TNF物質(zhì)少于對(duì)照組,Kupffer細(xì)胞內(nèi)TNF物質(zhì)也呈弱陽(yáng)性.Fn物質(zhì)以網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)沿血竇分布,并在匯管區(qū)呈較強(qiáng)陽(yáng)性,其肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈陰性,有的肝細(xì)胞胞質(zhì)空泡化呈弱陽(yáng)性.五靈膠囊組小鼠肝組織TNF物質(zhì)整體水平呈弱陽(yáng)性,中毒肝細(xì)胞呈散在性分布伴有TNF強(qiáng)陽(yáng)性物質(zhì)存在.竇腔內(nèi)細(xì)胞呈激活狀態(tài),其形態(tài)不規(guī)則;再生的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)TNF呈陰性核大而圓,染色質(zhì)豐富.Fn物質(zhì)以網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)沿血竇分布,并在匯管區(qū)、中央靜脈區(qū)均呈弱陽(yáng)性,其肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈弱陽(yáng)性,有的肝細(xì)胞空泡化其呈強(qiáng)陽(yáng)性.2.3小鼠肝組織受損部位HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠肝小葉圖像紊亂,有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),大部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的腫大,有的肝細(xì)胞體積縮小兩者雜亂排在一起,肝索相互靠攏,肝竇被擠變窄,甚至不明顯,小葉內(nèi)有壞死灶、散在累及區(qū)域8～10多個(gè)細(xì)胞不等,同時(shí)伴有嗜酸性變性其間有大量的淋巴細(xì)胞和中性細(xì)胞聚集,部分肝細(xì)胞質(zhì)疏松,透亮而染色淡,Kupffer和內(nèi)皮細(xì)胞明顯肥大,匯管區(qū)炎癥擴(kuò)大,一側(cè)有輕度碎屑性壞死.環(huán)磷酰胺組小鼠肝組織受損略重對(duì)照組,但炎癥細(xì)胞輕度浸潤(rùn),Kupffer細(xì)胞吞噬作用受抑制是其特點(diǎn).五靈膠囊組小鼠肝組織受損較輕,受損部位主要在中央靜脈周圍、其表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、胞核正常、部分胞質(zhì)疏松、肝竇變窄、有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、Kupffer細(xì)胞肥大,有吞噬象且分布多的區(qū)域損傷較輕,內(nèi)皮細(xì)胞激活,可見(jiàn)散在點(diǎn)狀壞死和嗜酸性變.3靈膠囊對(duì)肝組織病理學(xué)的作用BCG與LPS注射于小鼠體內(nèi)導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷,這種損傷是由致敏后的巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)所致.實(shí)驗(yàn)表明NO介導(dǎo)了Kupffer細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞毒性、TNF亦參與化學(xué)性、免疫性肝損傷.本實(shí)驗(yàn)表明五靈膠囊大劑量組小鼠肝微粒體液中NO值高于其余3組與正常組相似,而血清酶與組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)均未反映損傷明顯加重,提示肝損傷時(shí)肝組織內(nèi)NO水平并不升高,五靈膠囊大劑量使用能提高肝組織NO水平使之趨于正常,這對(duì)改善肝組織血液微循環(huán),加強(qiáng)組織血流灌注,促進(jìn)代謝是有益的,是活血化淤的作用之所在.LPS是不依賴T細(xì)胞的抗原,激活體內(nèi)B細(xì)胞亞群產(chǎn)生細(xì)胞因子,細(xì)胞因子中TNF被認(rèn)為是導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死的主要因素.本實(shí)驗(yàn)中免疫組化顯示:對(duì)照組肝組織嚴(yán)重受損區(qū)TNF物質(zhì)呈弱陽(yáng)性,而在濁腫病變輕微區(qū)TNF物質(zhì)呈最強(qiáng)陽(yáng)性,組織受損程度與TNF物質(zhì)表達(dá)的量顯示負(fù)平行關(guān)系,這種負(fù)平行關(guān)系可能是TNF導(dǎo)致組織受損后其本身被組織中其他酶代謝,故嚴(yán)重受損區(qū)TNF物質(zhì)呈弱陽(yáng)性.同時(shí)在受LPS損傷肝小葉內(nèi),肝小葉內(nèi)Kupffer細(xì)胞激活,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),血清ALT和AST酶水平升高,部分肝細(xì)胞輕微受損區(qū)域呈強(qiáng)陽(yáng)性,此時(shí)受損嚴(yán)重的肝組織Fn呈強(qiáng)陽(yáng)性,在中央靜脈區(qū)與匯管區(qū)受損輕微肝組織顯弱陽(yáng)性,提示Fn參與肝損傷的過(guò)程.五靈膠囊部分肝細(xì)胞TNF物質(zhì)呈散在分布,同時(shí)Kupffer細(xì)胞增生肥大,有吞噬象,Fn物質(zhì)呈弱陽(yáng)性,HE染色顯示肝組織損傷輕微,結(jié)果提示五靈膠囊能加速