國蘭蘭的繁殖與育種技術(shù)

國蘭蘭的繁殖與育種技術(shù)

蘭花是蘭科植物的總稱。這是世界上最重要的花卉植物，被認(rèn)為具有很高的裝飾價值。然而由于過度采挖和環(huán)境惡化,野生蘭花資源已經(jīng)遭到了嚴(yán)重破壞,目前全世界所有野生蘭科植物都被列入《野生動植物瀕危物種國家貿(mào)易公約》的保護(hù)范圍,為了保護(hù)和培育蘭花品種,合理利用蘭花資源,對蘭花的繁殖和育種技術(shù)提出了新的要求。常規(guī)蘭花繁殖方式一般通過分株進(jìn)行,但由于繁殖系數(shù)低,不利于優(yōu)種選育和推廣;而蘭花種子胚發(fā)育不完全,種皮致密、透性差,在自然條件下難以萌發(fā),也成為蘭花繁殖技術(shù)的難點(diǎn);隨著植物細(xì)胞工程的逐漸成熟,采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖,不僅能解決蘭花繁殖困難的問題,還可短期內(nèi)獲得大量種苗。傳統(tǒng)的蘭花品種培育建立在自然選種和引種馴化的基礎(chǔ)上,對蘭花種質(zhì)資源的破壞嚴(yán)重,甚至使許多品種處于瀕危狀態(tài)。基于組織培養(yǎng)條件下蘭花種子的無菌萌發(fā)技術(shù)得到了突破,雜交育種獲得的蘭花新品種正充斥著市場,引起研究者和消費(fèi)者的關(guān)注?，F(xiàn)結(jié)合目前常用的蘭花培育方法,從繁殖和育種2個方面進(jìn)行闡述,繁殖方法包括分株繁殖法、假鱗莖培養(yǎng)法、種子無菌播種繁殖法和組織培養(yǎng)法,育種方法包括引種馴化育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合誘變育種和基因工程育種等。這些方法各具特色,對不同品種的蘭花適用性不同,但都在一定程度上能解決蘭花培育過程中遇到的問題,為蘭花種質(zhì)資源的保護(hù)和新品種的培育提供了理論基礎(chǔ)。1蘭科植物的起源蘭花屬蘭科多年生草本植物,又名蘭草。蘭科是一個十分龐大的植物家族,屬于單子葉植物綱,全世界約有730屬,21500多種,廣泛分布于全球各地,但主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國約有蘭科植物173屬,1240余種。根據(jù)生活習(xí)性的不同,蘭花可分為地生蘭、附生蘭和腐生蘭三大類。蘭花開花結(jié)果的過程需要3~12個月,雖然在實(shí)驗(yàn)室、蘭圃、蘭室和蘭房中進(jìn)行人工授粉,洋蘭可成功獲得種子,但在國蘭中很難實(shí)現(xiàn),且由于缺少共生真菌等原因,自然條件下蘭花種子的萌發(fā)率極低。蘭花的培育至今仍無法解決大面積播種發(fā)芽的問題,這也是蘭花特別珍貴的一個重要原因。2蘭花的繁殖方法蘭花的繁殖方法主要有分株繁殖法、假鱗莖培養(yǎng)法、種子無菌播種繁殖和組織培養(yǎng)4種途徑。2.1假車蘭的選擇分株繁殖法在蘭花的栽培中應(yīng)用較多,尤其在種植量不大時應(yīng)用的較多,為傳統(tǒng)繁殖方法。分株繁殖適合于具有假鱗莖和叢生的蘭花,如中國蘭、兜蘭、文心蘭、石斛蘭和卡特蘭等。此法簡單,一般在植物生長周期的開始階段進(jìn)行,不需要特別的訓(xùn)練和儀器設(shè)備,而且在同樣的培養(yǎng)環(huán)境中能確保品種的固有特性,不會引起變異,但繁殖周期長,繁殖系數(shù)較低,1a只能產(chǎn)生1~2個新芽,且長期無性繁殖將造成帶病毒植株日益增多和品種退化。2.2扦插繁殖法假鱗莖培養(yǎng)法可分為直接繁殖和扦插繁殖2種。直接繁殖法是將假鱗莖用清水洗凈后直接栽植于小花盆中,每個老鱗莖能長出1~2枚新葉,而后在新芽基部生根成為新的植株,也屬于分株繁殖法中的一種,此法在貴重的蘭花品種和藝蘭品種栽培中應(yīng)用較多。而扦插繁殖法則是將假鱗莖剪成小段,扦插在用泥炭和苔蘚做成的小插床上,1~2個月后待新芽生出、且有2~3條小根時,栽植入新盆中成為新的植株。此法也可以在無菌環(huán)境中操作,將假鱗莖消毒滅菌后,在培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分化,經(jīng)過1a時間2~3次繼代,可以獲得3~4cm高、有2~3個新假鱗莖的小苗。2.3種子的處理與萌發(fā)由于蘭科植物種子發(fā)育不全,在自然條件下萌發(fā)率極低,繁殖困難,因此一般采收果莢后通過無菌播種方式來提高種子的萌發(fā)率。將蘭花蒴果流水沖洗后去掉兩端置于超凈工作臺內(nèi),然后用酒精和升汞對果莢表面消毒滅菌,無菌水沖洗干凈再用濾紙吸干水分。用刀片剖開蒴果,將種子取出后視情況進(jìn)行不同的處理,如采用NaOH、KOH、NaClO溶液浸泡或低溫處理等,最后將種子均勻?yàn)⒃谂囵B(yǎng)基表面進(jìn)行萌發(fā)。目前,對蘭花種子,尤其是國蘭的無菌播種方法尚沒有系統(tǒng)的研究,不同品種對培養(yǎng)基的要求也不一,萌發(fā)率無法得到明顯提高,萌發(fā)時間也較緩慢,阻礙了國蘭的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。2.4植物基因培養(yǎng)組織培養(yǎng)技術(shù)是通過無性繁殖快速獲得新植株的主要途徑,在洋蘭的種苗繁殖中廣泛應(yīng)用,而在國蘭中還有待完善,以保護(hù)其種質(zhì)資源和一些名貴品種。蘭花組織培養(yǎng)的一般步驟是首先選取活性強(qiáng)的外植體,流水沖洗干凈后轉(zhuǎn)至超凈工作臺用75%酒精和升汞消毒滅菌,無菌水沖洗干凈后接種于培養(yǎng)基上,觀察原球莖生長情況,記錄芽分化數(shù)和分化出芽的根狀莖數(shù)。待形成無菌苗后,在溫室里進(jìn)行練苗移栽。無菌苗的建立是植物組織培養(yǎng)的主要環(huán)節(jié),外植體污染以及褐化是該環(huán)節(jié)的主要問題。影響蘭花無菌苗體系建立的因素包括外植體的種類、消毒方法、消毒劑的種類及培養(yǎng)基的選擇等。2.4.1莖尖外植體材料蘭花的莖尖、葉片、種子,甚至花瓣、萼片、子房、花梗、側(cè)芽、花芽、莖段、根等都可以作為組織培養(yǎng)中的外植體材料。但在國蘭的組織培養(yǎng)中,外植體材料仍以莖尖和種子為主。莖尖:莖尖由于分生能力強(qiáng),是最早用于蘭花組培中的外植體材料。在春蘭、墨蘭、建蘭等國蘭中利用莖尖已經(jīng)成功誘導(dǎo)出原球莖,并進(jìn)一步分化為根狀莖,獲得大量蘭花組培苗。詹忠根研究表明,從苞葉未展開的新芽上切取的莖尖外植體材料,帶有1~2個葉原基(大于2mm),成活率較高。如果莖尖過小則活力弱,分裂繁殖部位少,而過大的外植體分裂增殖能力減弱易褐化。大花蕙蘭、文心蘭和蝴蝶蘭等洋蘭也適合用莖尖作為外植體。種子:蘭花經(jīng)授粉可結(jié)果且種子數(shù)量繁多,但由于其胚發(fā)育不完全,種皮致密、透性差或種皮中含有抑制物,缺少共生真菌,種子很難萌發(fā)。1824年Link發(fā)現(xiàn)自然條件下蘭花種子的萌發(fā)伴隨著真菌感染;之后研究者們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大部分蘭花種子還可以通過無菌方式進(jìn)行萌發(fā),即非共生萌發(fā),且萌發(fā)率因基因型而異。蘭花種子的非共生萌發(fā)已經(jīng)在許多國蘭和洋蘭中取得成功,如:蕙蘭、春蘭、蝴蝶蘭、石斛蘭、文心蘭等。黃磊等用春蘭(Cymbidumgoeringii)和大花蕙蘭(Cymbidiumhybrids)的雜交種子,經(jīng)非共生萌發(fā)得到了無菌試管苗。由于蘭花種皮的致密性,對部分蘭花種子進(jìn)行預(yù)處理有利于其萌發(fā),物理方法如光照、冷凍、超聲波處理等。田梅生等用剪刀將四季蘭種皮剪破后,種子的萌發(fā)率提高了3倍。還有一些化學(xué)方法處理也可以提高蘭花種子的萌發(fā)率,如NaClO和NaOH預(yù)處理等,明顯縮短了原球莖的形成時間。2.4.2培養(yǎng)基的改良為了提高植株再生率,不同的培養(yǎng)基在蘭花組織培養(yǎng)中均進(jìn)行了嘗試,如:MS、KC、VW、RM、H、White及其改良型等,其中添加有機(jī)物成分的VW培養(yǎng)基可以明顯增加蘭花根和葉的數(shù)量和重量,改良的MS、White或Kyoto培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)增殖原球莖,目前應(yīng)用最為廣泛的依然是MS培養(yǎng)基。有些培養(yǎng)基中還加入香蕉泥、椰子汁,以提供細(xì)胞生長分化所需要的營養(yǎng)物質(zhì),添加活性炭可以防止褐化。對于培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的量,研究表明春蘭需求較少,惠蘭要求較大,而墨蘭則不敏感。蘭花組織培養(yǎng)對所用培養(yǎng)基的pH值也有一定要求,一般呈弱酸性,以pH5.0~6.0為宜。2.4.3不同階段生長分化對原球莖、病枝條生長的影響蘭花的組織培養(yǎng)條件與其它物種差異不大,培養(yǎng)室的溫度、濕度、光照等環(huán)境條件對不同培養(yǎng)階段,如原球莖、根狀莖的生長與分化,都有一定程度的影響。培養(yǎng)室溫度以(25±3)℃最適宜,相對濕度一般保持在70%~75%,光照強(qiáng)度為1500lx左右,光照時間12h/d為宜,部分蘭花種子離體萌發(fā)時還需要黑暗培養(yǎng)一段時間,有利于原球莖的誘導(dǎo)增殖。2.4.4不同玫瑰花品種激素的最佳配方激素是植物組織培養(yǎng)技術(shù)得以推廣的助推器,在蘭花組培中可以誘導(dǎo)外植體和原球莖的分化增殖、再生植株的形成及一些蘭花種子的萌發(fā)。大量研究結(jié)果表明,不同蘭花品種,不同生長發(fā)育階段所需的激素種類、配比、濃度各不相同,根據(jù)具體條件設(shè)計相關(guān)的正交實(shí)驗(yàn)可以摸索出最優(yōu)的培養(yǎng)方案。蘭花組培培養(yǎng)基中添加的激素主要是生長素類和細(xì)胞分裂素類,生長素類可以促進(jìn)原球莖的誘導(dǎo)和生根,細(xì)胞分裂素類對原球莖的誘導(dǎo)和分化有利,Ehlers等研究表明,在蝴蝶蘭的培養(yǎng)基中配合使用生長素(NAA)和細(xì)胞分裂素(TDZ)可以成功誘導(dǎo)出愈傷組織和原球莖。3生種和馴化破壞野生蘭花樹的多樣性一直以來,蘭花新品種的培育是其重要經(jīng)濟(jì)價值的體現(xiàn)。傳統(tǒng)的蘭花育種以自然選種為主,我國蘭花資源中,一些野生種因具有很高的觀賞價值,適宜引種馴化,但挖掘、移栽并馴化的簡單育種方法使野生蘭花資源遭到了毀滅性破壞。自從種子無菌萌發(fā)成功后,育種方法多通過昆蟲授粉或者人工授粉,開展蘭花品種間、種屬間的雜交育種。隨著細(xì)胞工程和基因工程的廣泛開展和研究,原生質(zhì)體融合誘變育種、基因工程育種等新技術(shù)也在蘭花育種中進(jìn)行了嘗試。3.1品種的養(yǎng)殖引種馴化育種是最古老的傳統(tǒng)育種方法,其基礎(chǔ)作用在任何物種中都不可小覷。我國目前栽培的國蘭品種大多數(shù)也是直接通過野生種引種馴化而來,所得的新品種一般靠傳統(tǒng)的分株方法繁殖,然而這種方法獲得有經(jīng)濟(jì)價值的新品種耗時長,無法滿足市場發(fā)展的需求。而且野生蘭花資源不斷遭到破壞,資源逐步枯竭,采用引種馴化的育種方法走向沒落,因此,發(fā)掘有效的蘭花新品種培育方法勢在必行。3.2種花草種的誘導(dǎo)誘導(dǎo)蘭花的育種一直以自然選種為主,比起自然昆蟲授粉,人工授粉可以明顯提高蘭花的結(jié)果率。目前,蘭科人工雜交屬已達(dá)473個。由于洋蘭外形鮮艷,國蘭香味獨(dú)特,人們期望通過雜交育種,分別利用洋蘭和國蘭作為親本,能培育出兼具親本優(yōu)良性狀的蘭花新品種。然而,蘭花雜交種子的萌發(fā),是雜交育種的一個技術(shù)難點(diǎn),其在組培條件下的無菌萌發(fā)成為主要解決方法。張志勝等對蘭花的遠(yuǎn)緣雜交育種進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)國蘭類各種間雜交易成功;蘭屬和其它屬蘭花雜交結(jié)果率較低,種子量少;墨蘭和大花蕙蘭雜交結(jié)果率隨品種和正反交不同而異。通過雜交育種方式獲得蘭花新品種,其缺點(diǎn)是新品種性狀的可預(yù)見性較低,而且培育周期長。3.3原生質(zhì)體的分離和利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可以打破生殖隔離、克服遠(yuǎn)緣雜交的障礙,也被借鑒用來培育蘭花新品種。研究表明,蘭花幼嫩葉片、花梗、莖尖、根尖、原球莖、愈傷組織、懸浮細(xì)胞都可以分離出原生質(zhì)體,但不同的外植體獲得原生質(zhì)體的產(chǎn)量不同,無菌苗提供的外植體分離獲得原生質(zhì)體的效率高一些。與其它物種相比,蘭花原生質(zhì)體的融合較為困難,對蝴蝶蘭無菌苗幼嫩葉片中提取的原生質(zhì)體進(jìn)行電融合,融合率僅5%左右。雖然從原生質(zhì)體的分離至發(fā)育成為完整植株的周期較長,但是在愈傷組織形成期間,通過激素或物理化學(xué)作用誘導(dǎo)產(chǎn)生一些穩(wěn)定的新型性狀,也為培育蘭花新品種提供了新思路。3.4分子手段在基因育種中的應(yīng)用早期的基因工程育種采用物理、化學(xué)等方法對蘭花基因組進(jìn)行改造,如用紫外光和秋水仙素對春蘭誘導(dǎo)的原球莖進(jìn)行人工誘變,成功獲得新品種。隨著基因工程的開展,對蘭花基因組進(jìn)行靶向性突變培育新品種成為新的途徑,且倍受關(guān)注,然而蘭科植物對農(nóng)桿菌不敏感,缺乏合適的載體,進(jìn)展較緩慢。目前,利用分子