植物組織培養(yǎng)中的污染及其防治

植物組織培養(yǎng)中的污染及其防治

植物組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)初，是基于植物水生生殖區(qū)的植物育種和繁殖技術(shù)。經(jīng)過(guò)近1個(gè)世紀(jì)的發(fā)展,植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐上得到了廣泛應(yīng)用,特別是在植物的工廠化育苗方面。但是,在組織培養(yǎng)過(guò)程中,污染問(wèn)題難以回避;在生產(chǎn)中,污染率的增加必然提高組培苗成本,從而影響企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,因此防治污染是工廠化育苗中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文在分析植物組織培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生污染的原因及其性狀的基礎(chǔ)上,提出了防治污染的措施,以期為植物的工廠化育苗提供技術(shù)參考。1污染的原因和特點(diǎn)1.1表面細(xì)菌引起的污染內(nèi)因污染,又稱內(nèi)源性污染,是指由于外植體的表面或內(nèi)部帶菌(內(nèi)生菌)而引起的污染。這些病菌主要為內(nèi)源性細(xì)菌或真菌,如黃單胞菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬、歐文氏菌屬、霉菌屬等。在初代培養(yǎng)中,表面細(xì)菌引起的污染通常在2~3d內(nèi)即能在外植體周圍或培養(yǎng)基表面形成明顯的水污狀、油污狀、氣泡狀或干縮狀菌落,顏色有紅色、黃色、乳白色等。若在外植體接種后3~5d內(nèi)仍未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染,但是以后不斷出現(xiàn)明顯或不明顯的菌落,這就可能是由內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。在某些植物的初代培養(yǎng)或前幾代的繼代培養(yǎng)中,污染可能并不形成明顯的菌落,而只在培養(yǎng)基內(nèi)部形成不易被肉眼發(fā)現(xiàn)的絲狀物或暈狀物,隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加,細(xì)菌數(shù)量不斷增加,一段時(shí)間后即會(huì)在培養(yǎng)基上表現(xiàn)出來(lái),這種情況一般可以利用背光檢查法進(jìn)行觀察。1.2外因污染的病原菌外因污染主要是由環(huán)境污染和操作不當(dāng)引起,是指在接種或培養(yǎng)過(guò)程中病菌入侵而造成的污染,如培養(yǎng)基、接種工具和接種室消毒不嚴(yán)格以及操作不規(guī)范等。造成外因污染的病菌主要是霉菌、細(xì)菌和酵母菌等。若培養(yǎng)材料附近經(jīng)常出現(xiàn)黏液或混濁水跡并伴有發(fā)酵狀泡沫,這大多是細(xì)菌性污染,可能是由于使用了未消毒完全的工具引起的,也可能是由于操作人員呼吸排出細(xì)菌或接觸了培養(yǎng)材料或器皿所致。如培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃、白、黑等不同顏色的霉菌,則大多為真菌性污染,主要是由于接種室的空氣受到污染造成的。2外植體內(nèi)部帶菌針對(duì)植物組織培養(yǎng)中污染產(chǎn)生的原因,應(yīng)從以下兩個(gè)方面著手來(lái)控制污染。一是控制外植體自身帶菌,外植體的表面帶菌可以經(jīng)過(guò)一系列的殺菌處理來(lái)減少;而外植體的內(nèi)部帶菌是不容易清除的,但也可以通過(guò)對(duì)外植體的預(yù)培養(yǎng)來(lái)加以控制;二是降低環(huán)境污染和操作污染,這類污染可通過(guò)規(guī)范操作程序加以控制。2.1內(nèi)部污染防治2.1.1菌株b.條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)和致病菌生長(zhǎng)具有因首先應(yīng)控制外植體采摘的季節(jié)、時(shí)間和部位。外植體一般在材料休眠末期或萌動(dòng)前期取材較為有利,因?yàn)榇藭r(shí)材料積累了較豐富的營(yíng)養(yǎng)和內(nèi)源激素,其抵抗病菌的能力較強(qiáng)、同時(shí)病菌也還未活躍起來(lái)。其次應(yīng)選取無(wú)病毒的外植體,如外植體帶有病毒,則應(yīng)采取預(yù)栽管理、促發(fā)新枝、黃化處理、熱擊處理、添加抗生素等措施進(jìn)行處理,以培養(yǎng)出無(wú)病毒的外植體。2.1.2表面消毒保鮮外植體采摘后,通過(guò)表面滅菌、深滅菌或其他處理去除所帶病菌,這也是接種前的重要工作。(1)表面滅菌。先將采摘外植體洗去泥土,用洗潔劑浸泡、沖洗,必要時(shí)用軟刷或脫脂棉球擦洗材料表面,然后將其剪成適宜大小,再進(jìn)行深滅菌。(2)深滅菌。經(jīng)過(guò)表面滅菌后,仍有雜菌存在于外植體表面或內(nèi)部,必須經(jīng)過(guò)深滅菌處理才能獲得不帶菌的外植體,如添加消毒劑或抗生素、使用混合消毒液、水浴、灼燒、真空減壓滅菌、磁力攪拌滅菌、超聲波振動(dòng)滅菌以及多次消毒等。2.1.3有效之方法近年來(lái),培育無(wú)菌苗為外植體被公認(rèn)為是一種行之有效的方法。該法利用種子在無(wú)菌條件下培育成無(wú)菌苗,然后再將無(wú)菌苗的胚軸、胚根、子葉等作為外植體,這樣可減少污染,提高成活率。2.2控制外污染2.2.1控制污染接種室應(yīng)該密封、潔凈,每次接種前應(yīng)清潔接種室的地面,用75%酒精噴霧以沉降灰塵,并打開紫外燈在黑暗中滅菌20~30min;用新潔爾滅或75%酒精擦洗工作臺(tái)面,使用超凈工作臺(tái)對(duì)控制污染更為有效;定期清洗過(guò)濾膜;此外,培養(yǎng)室的空氣相對(duì)濕度應(yīng)控制在70%左右,濕度太高時(shí)可用抽濕機(jī)除濕。在接種結(jié)束時(shí),也應(yīng)清潔接種室的地面,并定期用甲醛熏蒸。2.2.2接種及考核操作人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)操作,穿戴專用的無(wú)菌鞋、工作服、工作帽、口罩及發(fā)罩,用消毒液洗手;接種過(guò)程中不應(yīng)頻繁開啟接種室門窗;定期打掃或用甲醛熏蒸培養(yǎng)室和接種室,檢查超凈工作臺(tái)的衛(wèi)生質(zhì)量;及時(shí)處理被污染的培養(yǎng)瓶,而不應(yīng)隨意棄置,以防病菌傳播。2.2.3滅鍋、培養(yǎng)容器對(duì)接種材料要嚴(yán)格把關(guān),淘汰被污染的接種材料;檢查滅菌鍋的質(zhì)量,如嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)操作后仍有污染現(xiàn)象,則應(yīng)及時(shí)檢查滅菌鍋的性能;檢查培養(yǎng)容器是否存在污染問(wèn)題,培養(yǎng)容器大多用塑料蓋、膠塞、棉塞或薄膜等封口,其中塑料蓋使用太久后易老化、密封性較差,也會(huì)造成污染。培養(yǎng)瓶要充分洗凈并消毒,滅菌后不應(yīng)放在空氣中太長(zhǎng)時(shí)間,一般于滅菌后1~2d接種為宜,以減少污染。2.2.4減少培養(yǎng)基中有機(jī)成分除了歐文氏菌屬外,大多數(shù)細(xì)菌在介質(zhì)pH值小于4.5時(shí)不能生長(zhǎng),因此可以通過(guò)酸化培養(yǎng)基來(lái)減少污染。例如在薔薇屬植物的組織培養(yǎng)中,將培養(yǎng)基的pH值從5.8降至3.9~4.3,可有效防止細(xì)菌污染。此外,也可以通過(guò)減少培養(yǎng)基中的有機(jī)成分來(lái)防止污染,因?yàn)榕囵B(yǎng)基中有機(jī)成分的存在是產(chǎn)生污染的重要原因。例如在阿月渾子的組織培養(yǎng)中,去除培養(yǎng)基中的維生素B1、B6和煙酸等有機(jī)成分,經(jīng)2~3代培養(yǎng)后即能抑制細(xì)菌生長(zhǎng),而對(duì)叢生芽的生長(zhǎng)增殖不產(chǎn)生影響,這是因?yàn)榫S生素B1、B6和煙酸等是某些細(xì)菌生長(zhǎng)的必需物質(zhì),去除這些有機(jī)成分后細(xì)菌因無(wú)法生長(zhǎng)發(fā)育而慢慢減少或死亡。日本古在豐樹教授首創(chuàng)的無(wú)糖組織快繁技術(shù)則是去除培養(yǎng)基中的全部有機(jī)成分,輸入CO2作為碳源,并通過(guò)控制環(huán)境因子,促進(jìn)植株光合作用,使之由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變成自養(yǎng)型,經(jīng)過(guò)這樣處理的植株長(zhǎng)勢(shì)良好,污染率明顯降低。2.2.5抗生素的使用在理論上來(lái)說(shuō),已經(jīng)獲得的無(wú)菌材料應(yīng)該是無(wú)菌的,但在繼代培養(yǎng)中也會(huì)被污染。除了操作不慎外,內(nèi)生菌的活動(dòng)也是導(dǎo)致污染的一個(gè)重要原因。此外,繼代材料放在培養(yǎng)架上也可能被螨類等傳播的病菌污染。上述污染可通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抗生素來(lái)防止,一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基被污染應(yīng)立即剔除,并對(duì)接種室和培養(yǎng)室進(jìn)行紫外燈照射或藥液熏蒸?？股匾志趧?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中早已被廣泛應(yīng)用,但在植物組織培養(yǎng)中尚處于初始階段。近年來(lái),隨著植物基因工程的開展,轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的除菌和抑菌越來(lái)越離不開抗生素,因此抗生素的使用已逐漸成為植物組織培養(yǎng)的滅菌技術(shù)之一。但是,在使用抗生素時(shí)必須弄清抑制的病菌種類、使用的抗生素是否對(duì)培養(yǎng)的植物組織有不良影響以及抗生素的使用濃度和處理時(shí)間。由于能對(duì)所有微生物都有效的抗生素是不存在的,因此抗生素也不能完全代替滅菌技術(shù),而最好的方法就是將其添加在培養(yǎng)基中作為防止污染的輔助措施。3組培苗的污染防治隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,植物的快繁技術(shù)呈現(xiàn)日新月異的變化。但是,在植物組培苗的工廠化生產(chǎn)過(guò)程中,由于污染造成生產(chǎn)成本偏高或產(chǎn)品不合格的情況時(shí)有發(fā)生,嚴(yán)重影響了組培苗的工廠化生產(chǎn)進(jìn)程,因此開展