動物細(xì)胞融合

實驗二十六動物細(xì)胞融合實驗?zāi)康牧私鈩游锛?xì)胞融合的常用方法。學(xué)習(xí)化學(xué)融合的基本操作過程及其應(yīng)用。觀察動物細(xì)胞融合過程中細(xì)胞的行為和變化。實驗原理細(xì)胞融合:指在培養(yǎng)或誘導(dǎo)條件下，兩個或兩個以上細(xì)胞合并為雙核或者多核細(xì)胞的過程；又叫細(xì)胞雜交，分為同核和異核。成功的標(biāo)志為：融合后的細(xì)胞能正常分裂、生長。動物細(xì)胞融合的方法：病毒誘導(dǎo)融合：利用仙臺病毒等被膜中含有融合蛋白的病毒，通過改變動物細(xì)胞細(xì)胞膜的脂雙層促使動物細(xì)胞融合。化學(xué)誘導(dǎo)融合：利用化學(xué)試劑如聚乙二醇（PEG），利用相似相溶的原理，改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細(xì)胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過程中相接觸的細(xì)胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細(xì)胞融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合。融合過程：細(xì)胞接觸一一膜融合一一形成啞鈴型細(xì)胞。化學(xué)誘導(dǎo)融合方法，操作方便，融合效率高。附：PEG的分子量：400-6000道爾頓，其中科研時采用800-1000道爾頓。PEG的濃度：40%-60%作用時間：1分鐘（科研）PH：8.0-8.2溫度：38-40°C電激誘導(dǎo)融合：基于顯微鏡下的細(xì)胞融合，其中電誘導(dǎo)（激光誘導(dǎo)）是先使細(xì)胞在電場中極化成為電偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖（激光）擊破細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。電激誘導(dǎo)融合方法具有無毒高效的優(yōu)點。本次實驗選用化學(xué)誘導(dǎo)融合方法。實驗用品材料：雞血紅細(xì)胞。試劑：0.85%氯化鈉溶液，GKN溶液（磷酸緩沖液），Alsever’s細(xì)胞保存液，50%PEG。器材：顯微鏡、離心機、離心管、載玻片、蓋玻片。實驗步驟取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液。（可在4C保存）往離心管中?、?ml+4ml0.85%的NaCl溶液，進(jìn)行一次1000r/min、5min離心取出離心管，抽出上清液，加入GKN液4ml使細(xì)胞濃度適宜，采用吹氣泡等方法混勻，制成懸液。取出三個離心管：第一個加入1ml，第二個加入0.5ml，第三個加入0.5ml上述懸液。在第一個管中加入0.5mlPEG溶液，接觸30-40s時混勻；在第二個管采取上述相同操作；在第三個管中加入1mlPEG溶液，接觸少于30s后混勻；靜置2-3min。分別取上述溶液制成裝片，在顯微鏡下觀察并記錄三個條件下的融合情況以及融合過程。實驗完畢后，清洗實驗器材并置于原處。實驗結(jié)果

接觸融合融合后1ml+0.5mlPEG0.5ml+0.5mlPEG0.5ml+1mlPEG接觸融合融合后1ml+0.5mlPEG0.5ml+0.5mlPEG0.5ml+1mlPEG由實驗結(jié)果可得隨著PEG的濃度的增加，細(xì)胞的融合率不斷增加;同時細(xì)胞變形所需的時間越短.故而，在科研過程中PEG作用的時間應(yīng)維持在1min左右.同時細(xì)胞濃度越小，融合率越高.分析與討論在觀測過程中發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞堆積的現(xiàn)象,不易于觀察,因此在實驗過過程中，應(yīng)注意控制細(xì)胞濃度,且在兩次混勻時要注意徹底混勻.1ml(0.5ml)細(xì)胞溶液+0.5mlPEG條件下，應(yīng)注意在兩者接觸30-40S時在混勻,如此實驗結(jié)果會更明顯，但在0.5ml細(xì)胞溶液+1mlPEG條件下，接觸時間應(yīng)少于30s.以免細(xì)胞變形.在實驗過程中，應(yīng)在作用2-3min后在觀察，但時間不應(yīng)太久,否則細(xì)胞變形將影響觀察.在觀察中應(yīng)將光圈調(diào)小，如此實驗結(jié)果將更明顯.在觀察過程中應(yīng)仔細(xì)耐心,注意區(qū)分重疊和接觸的不同.動物細(xì)胞融合的應(yīng)用動物細(xì)胞融合是從細(xì)胞水平來改變動物細(xì)胞的遺傳性，用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品，改良培育動物新品種，縮短動物的育種過程。動物細(xì)胞融合的應(yīng)用范圍已廣及生物學(xué)的各個分支學(xué)科，特別是在繪制人類基因圖譜方面取得了顯著成績。雖然細(xì)胞雜交屬于理論生物學(xué)范疇，但在實際應(yīng)用方面也有重大突破。在基礎(chǔ)理論研究上，動物細(xì)胞融合技術(shù)對研究細(xì)胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機制等方面都有重要意義。在實際應(yīng)用方面，動物細(xì)胞融合技術(shù)在藥物定向釋放系統(tǒng)、細(xì)胞治療以及抗腫瘤免疫等方面起到重要的作用。動物體細(xì)胞雜交技術(shù)主要應(yīng)用于以下幾個方面。一、 用于基因定位和繪制人類基因圖譜JP2雜種細(xì)胞中某一染色體或其片段的存在與否與細(xì)胞的某一性狀表達(dá)與否相聯(lián)系，從而可以實現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。1967年Weise和Green發(fā)現(xiàn)在人和鼠的融合細(xì)胞中，人的染色體優(yōu)先丟失，并證明利用這一特點有可能對人染色體上的基因進(jìn)行定位。1970年Ruddle等開始系統(tǒng)地用融合細(xì)胞作為實驗系統(tǒng)來繪制人類基因圖。二、 用于生產(chǎn)樹突狀細(xì)胞抗腫瘤疫苗一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表面抗原不能誘導(dǎo)強的免疫應(yīng)答反應(yīng)，樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)與腫瘤細(xì)胞融合形成的樹突狀細(xì)胞疫苗能夠有效地激發(fā)機體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，無論是在動物研究還是在人體早期臨床試驗中都證明這是一種方便、安全、可行的方法。并且由于融合細(xì)胞可以在體內(nèi)存活，因此可以維持較長時期的免疫應(yīng)答，有利于誘發(fā)機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫。腫瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式與DCs結(jié)合，或者將腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)化進(jìn)DCs中，使其內(nèi)源性地表達(dá)抗原，這兩種方法在抗腫瘤免疫應(yīng)答中均有效，但適于免疫的腫瘤抗原及其基因難以鑒定從而限制了其應(yīng)用，有實驗證明用這兩種方法制備的腫瘤疫苗的免疫原性不及腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞直接融合的異核細(xì)胞，融合細(xì)胞保持了DCs和腫瘤細(xì)胞的特性，并且能高效地將未知的腫瘤抗原提呈給免疫系統(tǒng).三、 用于生產(chǎn)單克隆抗體使小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成能產(chǎn)生單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）的雜交瘤細(xì)胞，單克隆抗體具有專一性和靈敏性，作為理論研究的工具在病原檢測和疾病治療以及食品安全領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前有關(guān)單位利用McAb作用的專一性這一特點正在探索用“生物導(dǎo)彈”對癌癥進(jìn)行早期診斷和治療。四、 用于動物育種體細(xì)胞核移植技術(shù)（somaticcellnucleartransfertechnique,SCNT）是將細(xì)胞核移植到另一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的生物技術(shù)。動物體細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞難以發(fā)育再生為一個個體，但借助于細(xì)胞核移植的方法將融合后雜種細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細(xì)胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進(jìn)行的哺乳動物體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)打下良好的實驗基礎(chǔ)。五、 用于細(xì)胞療法SCNT將患者的任何體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合，融合子進(jìn)行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內(nèi)細(xì)胞團是多能干細(xì)胞，對多能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來源問題，并且也避免了宿主對外來物的免疫排斥。六、 動物體細(xì)胞融合在基礎(chǔ)理論研究方面的應(yīng)用（1）用于研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系和個體發(fā)育。20世紀(jì)70年代初，誕生了細(xì)胞拆合工程。Carter于1967年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素B（CB）能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠L細(xì)胞的排核作用。Prescott等1972年首先應(yīng)用離心術(shù)結(jié)合CB分離哺乳類細(xì)胞的胞質(zhì)體獲得成功，為研究哺乳類細(xì)胞的核、質(zhì)相互關(guān)系、細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移開創(chuàng)了新的途徑。異核體和細(xì)胞雜合子被用來確定基因調(diào)節(jié)因子，這些調(diào)節(jié)因子決定一個細(xì)胞表型消失或得以保持以及賦予受體新性狀；通過對供體和受體細(xì)胞所有細(xì)胞特異性基因表達(dá)研究，細(xì)胞融合有助于人們了解發(fā)育，特別是在研究基因編碼的可逆性方面。在個體發(fā)育過程中，血紅蛋白存在著從胚胎型向胎兒型（幼蟲）最終向成人型的轉(zhuǎn)換，對這些轉(zhuǎn)換進(jìn)行研究，除了揭示基因順序表達(dá)的調(diào)控機理外，在醫(yī)學(xué)方面也有意義，人們可以部分或全部扭轉(zhuǎn)從胚胎型向胎兒型的轉(zhuǎn)變從而治療鐮刀型貧血病。（2） 用于揭示疾病發(fā)生的機制。與其他技術(shù)結(jié)合使用，細(xì)胞融合是一種揭示疾病機理的有效方法。例如，細(xì)胞融合與免疫熒光，生化分析，電鏡技術(shù)相結(jié)合，LattanziG等對肌肉萎縮癥發(fā)生的機理進(jìn)行了研究。（3） 用于膜蛋白動力學(xué)研究