病原免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)：牛奶對(duì)小鼠抗胰島細(xì)胞抗體（ICA）的影響

牛奶對(duì)小鼠抗胰島細(xì)胞抗體（ICA）的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

問題

背景預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論目錄2

1型糖尿病，原名胰島素依賴型糖尿病——是嚴(yán)重威脅青壯年和少年兒童健康的重要疾病。與更常見的2型糖尿病相比,典型1型糖尿病的特點(diǎn)包括發(fā)病年齡較輕，起病迅速，“三多一少”等癥狀明顯，常有自發(fā)酮癥傾向，胰島素分泌顯著下降甚至缺失，需終身胰島素治療維持生命。該病患者的血糖控制往往較差，對(duì)青少年兒童生長(zhǎng)發(fā)育、育齡婦女妊娠有不利影響，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命。1眼

腦

心血管

腎

背景3確認(rèn)免疫介導(dǎo)1型糖尿病，主要依賴在糖尿病患者中檢出針對(duì)胰島β細(xì)胞各種抗原的自身免疫抗體。

抗胰島細(xì)胞抗體（Isletcellautoantibodies,ICA）屬器官特異型抗體，主要為lgG類，抗原為胰島細(xì)胞漿成分或微粒體組分，是胰島β細(xì)胞損傷的標(biāo)志。對(duì)1型糖尿病的診斷具有一定價(jià)值。2-3

ICA見于初診斷的1型糖尿病患者，總陽(yáng)性率31.2%，在起病的頭兩周內(nèi)可高達(dá)85%，數(shù)周后降至50%；而在非胰島素依賴性糖尿病和“化學(xué)性”糖尿病人，陽(yáng)性率僅為6.2%和4.9%，故可作胰島素依賴性和非依賴性糖尿病的鑒別診斷依據(jù)。4背景4許多研究提示牛奶(含牛血清白蛋白BovineSerumAlbumin,BSA等）可能是引起1型糖尿病的重要飲食因素，1型糖尿病易感者的發(fā)病和在嬰兒期進(jìn)食牛奶有關(guān)。對(duì)于1型糖尿病的動(dòng)物模型BB大鼠和NOD小鼠，在斷奶初期給與牛奶或BSA，可使糖尿病的發(fā)病率明顯提高。在1型糖尿病患者血清中可以檢測(cè)出BSA及其他牛奶蛋白抗體。5Karges等用牛奶蛋白被水解后所得的飼料(稱為Nutramigen)喂養(yǎng)NOD小鼠10周以上，到第32周，1型糖尿病發(fā)生率明顯低于對(duì)照組(4.6%vs.58.8%)。未患糖尿病的小鼠胰島素儲(chǔ)備功能良好，胰島無炎癥反應(yīng)。6背景5確認(rèn)免疫介導(dǎo)1型糖尿病，主要依賴在糖尿病患者中檢出針對(duì)胰島β細(xì)胞各種抗原的自身免疫抗體。

抗胰島細(xì)胞抗體（Isletcellautoantibodies,ICA）屬器官特異型抗體，主要為lgG類，抗原為胰島細(xì)胞漿成分或微粒體組分，是胰島β細(xì)胞損傷的標(biāo)志。對(duì)1型糖尿病的診斷具有一定價(jià)值。2-3

ICA見于初診斷的1型糖尿病患者，總陽(yáng)性率31.2%，在起病的頭兩周內(nèi)可高達(dá)85%，數(shù)周后降至50%；而在非胰島素依賴性糖尿病和“化學(xué)性”糖尿病人，陽(yáng)性率僅為6.2%和4.9%，故可作胰島素依賴性和非依賴性糖尿病的鑒別診斷依據(jù)。4背景6本實(shí)驗(yàn)將通過間接免疫法，檢測(cè)小鼠血清中ICA，估測(cè)血清中ICA的含量。探討飲用牛奶對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞各種抗原的自身免疫抗體產(chǎn)生的影響。原創(chuàng)點(diǎn)：

探究牛奶對(duì)小鼠ICA產(chǎn)生有無影響。問題7實(shí)驗(yàn)方法：間接免疫熒光法及ELISA法觀察指標(biāo)：間接免疫熒光法：熒光顯微鏡下所觀察到的熒光圖像，主要以兩個(gè)指標(biāo)判斷結(jié)果，一是形態(tài)學(xué)特征，二是熒光強(qiáng)度。ELISA法：酶標(biāo)儀測(cè)得的OD值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)8實(shí)驗(yàn)對(duì)象：清潔級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，20-25g，60只（由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供）實(shí)驗(yàn)儀器：小鼠胰島細(xì)胞抗體（ICA）檢測(cè)試劑盒（上海研生實(shí)業(yè)有限公司）酶標(biāo)儀熒光顯微鏡離心機(jī)水浴鍋37℃溫箱等。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)9實(shí)驗(yàn)材料試劑：待測(cè)標(biāo)本：各組小鼠眼球血標(biāo)本，小鼠血清大白鼠胰腺切片熒光素標(biāo)記的ICA抗抗體pH7.40.01mol/L磷酸鹽緩沖鹽水（PhosphateBufferedSaline,PBS）低聚果糖菊粉富硒酵母實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)101、成分牛奶制備

根據(jù)普通成人每日飲用500mL（按60kg體重計(jì)）牛奶計(jì)算，由于樣品量超出動(dòng)物最大承受量，需要將樣品濃縮。故將成分牛奶配方設(shè)計(jì)為：稱取低聚果糖120g、菊粉50g和富硒酵母1.5mg加入100mL牛奶中，水浴鍋中預(yù)熱到80℃，經(jīng)過高速剪切混勻、均制、殺菌后作為成分牛奶供試液，即將功效成分增加100倍，相當(dāng)于人體推薦量每日5mL/60kg。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟112、小鼠分組

根據(jù)本試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)要求及成分牛奶供試液的推薦劑量，設(shè)定低、中、高3個(gè)劑量組為每日0.4mL/kg·bw、0.8mL/kg·bw和2.5mL/kg·bw（連續(xù)給藥30天），相當(dāng)于人體推薦量（5mL/60kg成分牛奶）的5倍、10倍、30倍即取供試液0.4mL、0.8mL、2.5mL，加蒸餾水至20mL，對(duì)小鼠灌胃。7實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟122、小鼠分組組號(hào)處理（連續(xù)30天）（成分牛奶）成分牛奶蒸餾水1低劑量組0.4mL/kg·bw0.4mL20mL2中劑量組0.8mL/kg·bw0.8mL3高劑量組2.5mL/kg·bw2.5mL4對(duì)照組蒸餾水實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟133.摘除眼球采血（1）左手拇、食指抓取小鼠雙耳及頸后皮膚，小指固定尾部；（2）中指將小鼠左側(cè)前肢輕壓在胸骨心臟部位，無名指按在腹部，

捻動(dòng)拇指，輕壓取血側(cè)眼部皮膚，使眼球充血突出；（3）用彎頭鑷夾取眼球；（4）根據(jù)需要捻動(dòng)拇指與食指的方向，使血液從眼眶內(nèi)以不同速度垂直流入離心管；（5）同時(shí)用左手中指輕按小鼠心臟部位，以加快心臟泵血速度；（6）當(dāng)血液流盡時(shí)，用脫臼法處死小鼠。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟144.分離血清（1）將離心管中的血置37℃溫箱或水浴1h，也可室溫2h；（2）再置4℃冰箱內(nèi)3～4h或過夜；（3）待血液凝固血塊收縮后，4000rpm離心10min；（4）取上清于干凈的離心管中，保存于-20℃，或加入防腐劑(0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉)，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟15間接免疫熒光法：5、標(biāo)本片制備

載玻片處理：取新載玻片依次用洗衣粉溶液浸泡—流水沖洗—清潔液浸泡—流水沖洗—蒸餾水沖洗1遍—95%乙醇過一遍—烘干。

標(biāo)本片選用大白鼠胰腺切片。

用丙酮、無水乙醇或四氯化碳等室溫固定3-10min，或4℃固定30min。(蛋白抗原)標(biāo)本固定后需立即以冷的0.01mol/LpH7.4PBS浸洗三次，每次3min，然后晾干待用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟16間接免疫熒光法：6、染色

間接法：于固定的標(biāo)本上先滴加小鼠血清，置37℃濕盒內(nèi)30min，用pH7.4PBS輕輕沖洗后連續(xù)通過3缸PBS浸洗，每次5min。再于標(biāo)本片上滴加熒光素標(biāo)記的ICA抗抗體，置于37℃濕盒內(nèi)30min，同法浸洗后吹干待檢。每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟17間接免疫熒光法7、封片

于已染色的標(biāo)本片上滴加緩沖甘油（甘油1份、0.01mol/LpH7.4PBS1份）一滴，蓋上蓋玻片。封片后可降低熒光素的光致猝滅。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟18ELISA法:5、加樣對(duì)低、中、高劑量組分別進(jìn)行：1-7孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品；后5孔中，待檢標(biāo)本（牛奶組小鼠血清）2孔、陰性對(duì)照（對(duì)照組小鼠血清）1孔、空白對(duì)照（樣品稀釋液）2孔；每孔100μL，37℃，120min；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟19ELISA法:6、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μL(取1μL生物素標(biāo)記抗體加99μL生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制)，37℃，60min。7、溫育60min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，350μL/每孔，甩干。8、每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液)

100μL，37℃，60min。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟20ELISA法:9、溫育60min后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2min，350μL/每孔，甩干。10、依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色(30min內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止)。11、依序每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟21ELISA法:12、用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟226、觀察間接免疫熒光法：

熒光顯微鏡下所觀察到的熒光圖像，主要以兩個(gè)指標(biāo)判斷結(jié)果，一是形態(tài)學(xué)特征，二是熒光強(qiáng)度，必須將兩者結(jié)合來綜合判斷。

根據(jù)特異性熒光強(qiáng)度用“+++”、“++”、“+”表示，無特異性熒光記“-”。特異性熒光呈光綠色。ELISA法：

觀察顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定每孔OD值；作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢標(biāo)本ICA濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-步驟23間接免疫熒光法：牛奶飲用組的小鼠血清抗體特異性熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，強(qiáng)度且隨著牛奶劑量的增大而增大。ELISA法：計(jì)算得出的待檢標(biāo)本ICA濃度高于對(duì)照組，且隨著牛奶劑量的增大而增大。牛奶喂養(yǎng)促進(jìn)ICA的產(chǎn)生?？赡芡?型糖尿病的產(chǎn)生有聯(lián)系。預(yù)期結(jié)果24參考文獻(xiàn)李琳，鄢盛愷，代謝綜合征及其實(shí)驗(yàn)室診斷的研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010,31（7）：699-701歐陽(yáng)玲莉，周智廣，彭健，等.胰島素自身抗體在診斷1型糖尿病的價(jià)值[J].中華內(nèi)分泌雜志，2004,20（3）：232-233BingleyPJ,BonifaeioE,MuckerPW,etal.Diabetesantibodystandardizationprogram:firstassayproficiencyevaluation[J].Diabetes,2003,52(5):1128-1136王慶淑.糖尿病自身抗體陽(yáng)性與胰島細(xì)胞功能關(guān)系的研究，2011Aug,20(22):2757周仁.牛奶蛋白與1型糖尿病[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2002,22(5)：298-300KargesW,Hammond-McKibbenD,CheungRK,etal.ImmunologicalaspectsofnutritionaldiabetespreventioninNODmice:apilotstudyforthecow'smilk-basedIDDMpreventiontrial[J].Diabetes,1997,46:557-564.任璐,張鋒華,苗君蒞,蔡濤,王輝,肖楊.功能牛奶對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究，2013,34（7）：24-29ClemensRA1.MilkA1andA2peptidesanddiabetes.NestleNutrWorkshopSer