肌源性干細(xì)胞體外篩選與增殖

肌源性干細(xì)胞體外篩選與增殖

0肌源性干細(xì)胞肌肉起源性干預(yù)是從骨骨骼肌腱分離的多能干燥物，具有多分枝潛力和自我更新能力。在沒有誘導(dǎo)因素的情況下，可將其定向分為肌細(xì)胞和肌組織。在特定的誘導(dǎo)條件下，它也可以傳播到具有特定形狀特征和功能的其他成體細(xì)胞類型?，F(xiàn)有關(guān)于肌源性干細(xì)胞的研究多在幼齡小鼠中進(jìn)行,因幼齡動物生長發(fā)育迅速,肌源性干細(xì)胞含量相對較高,分離培養(yǎng)相對容易;針對大鼠和人類尤其是成熟個體的研究較少,而疾病的治療多是針對成體進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)在健康純系成年SD大鼠中進(jìn)行,利用密度梯度離心及貼壁分離法對肌源性干細(xì)胞進(jìn)行分離純化,探討建立穩(wěn)定、高效地分離和培養(yǎng)肌源性干細(xì)胞的方法,以得到純度較高的肌源性干細(xì)胞。1細(xì)胞培養(yǎng)和生長設(shè)計(jì):細(xì)胞學(xué)體外觀察。時間及地點(diǎn):于2004-05/2006-06在解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)完成。材料:4～6周齡雌性SD大鼠16只,體質(zhì)量200～250g,由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物質(zhì)量合格證號:SCXK(渝)20020003,實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。主要試劑:實(shí)驗(yàn)方法:培養(yǎng)基的配制:生長培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)10%馬血清、0.5%雞胚提取液、1%青/鏈霉素的DMEM。分化培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM。骨骼肌細(xì)胞的消化分離:大鼠以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,腿部備皮后,用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡5min滅菌。無菌條件下取腓腸肌,D-Hank’s液沖洗后,顯微鏡下盡可能剔除脂肪、肌腱、神經(jīng)和血管。稱質(zhì)量后,用將肌組織剪成碎塊(<1mm3),移入離心管中。D-Hank’s液吹打漂洗3次,并靜置1min,離心后棄去上層液及漂浮組織,加入0.2%XI型膠原酶,37℃消化1h,離心后去上清液;加入2.4U/mLdispase,37℃孵育1h,離心后去上清液;加入1g/L胰酶,37℃消化30min,血清中止消化離心后去上清液。生長培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,反復(fù)吹打后過100,200,400目細(xì)胞篩網(wǎng),收集濾液,800g離心5min,棄上清液,細(xì)胞團(tuán)塊用2mL生長培養(yǎng)基重懸。肌源性干細(xì)胞的純化:密度梯度離心法:在離心管中加入60%percoll分離液(1.077g/mL)2mL,20%percoll分離液(1.031g/mL)2mL,形成有清晰界面的2層;反復(fù)吹打上述細(xì)胞懸液,使之成為單細(xì)胞懸液;離心管中緩慢加入單細(xì)胞懸液2mL,800r/min密度梯度離心20min;收集60%與20%percoll分界面處的呈云霧狀的單個核細(xì)胞界面層細(xì)胞;無血清培養(yǎng)基漂洗3次,離心后用2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液;錐蟲藍(lán)染液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞存活率≥95%方可繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。preplate差速貼壁法:將密度梯度離心法分離的細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的盛有完全培養(yǎng)基的50mL培養(yǎng)瓶中,放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2完全飽和濕度條件的孵箱中培養(yǎng)1h,貼壁細(xì)胞為pp1;未貼壁細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)2h,貼壁細(xì)胞為pp2;未貼壁細(xì)胞懸液再轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)18h,貼壁細(xì)胞為pp3;未貼壁細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)24h,貼壁細(xì)胞為pp4。以后間隔24h轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)至pp6。pp6培養(yǎng)3d后換液,以后每天換液1次,倒置顯微鏡下觀察,待原代細(xì)胞生長至14～16d,70%融合后傳代培養(yǎng)。骨骼肌肌源性干細(xì)胞傳代培養(yǎng)和生長曲線繪制:使用2.5g/L胰酶將貼壁細(xì)胞消化分離,胎牛血清終止消化;以5mLDMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞,1000r/min離心10min,洗滌2次,反復(fù)吹打使之成單細(xì)胞懸液;以1×109L-1傳代接種,每天隨機(jī)取樣,2.5g/L胰蛋白酶消化計(jì)數(shù),取平均數(shù)描記生長曲線。取平均描記傳1代、傳4代、傳7代的細(xì)胞生長曲線。肌源性干細(xì)胞的鑒定:以第2代細(xì)胞制作細(xì)胞爬片,行desmin,CD34,CD45,Sca-1抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色,以成纖維細(xì)胞作為陰性對照;其中CD34,CD45二抗為Cy3標(biāo)記,Sca-1二抗為FITC標(biāo)記,熒光顯微鏡下觀察記錄。Cy3激發(fā)波長520nm,FITC激發(fā)波長490nm,陽性呈黃綠色(FITC)或桔紅色(Cy3)。主要觀察指標(biāo):(1)不同接種密度對肌源性干細(xì)胞生長的影響。(2)傳代細(xì)胞的生長曲線。(3)骨骼肌肌源性干細(xì)胞的鑒定。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評估者:設(shè)計(jì)為第一作者,實(shí)施與評估為全體作者,均經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn),未使用盲法評估。2結(jié)果2.1培養(yǎng)pp1pp4細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)變化骨骼肌塊經(jīng)消化后可獲得以骨骼肌細(xì)胞、血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等為主要成分的混合細(xì)胞產(chǎn)物,使用percoll密度梯度離心法處理后,血細(xì)胞成分基本消除。嚴(yán)格進(jìn)行preplate分離技術(shù),可見pp1～pp4細(xì)胞均以成纖維細(xì)胞為主,貼壁迅速,數(shù)量多,分裂增殖旺盛,未經(jīng)傳代則快速發(fā)生融合。pp6貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少,體積較小,貼壁緩慢,折光性較好,多呈球形、梭形或紡錘形,增殖緩慢,另有少量細(xì)胞仍處于懸浮狀態(tài)。pp6細(xì)胞培養(yǎng)72h后,細(xì)胞數(shù)量明顯增多,以紡錘形及梭狀為主,見圖1。培養(yǎng)5～7d后,懸浮細(xì)胞基本消失,貼壁細(xì)胞分裂增殖明顯,可見較多分裂相,細(xì)胞密度明顯增加,胞體逐漸舒展,細(xì)胞體積增大,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較大變化,可見長梭形、長棱形的細(xì)胞貼壁生長。培養(yǎng)12～14d,貼壁細(xì)胞繼續(xù)繁殖,細(xì)胞密度增大,并逐漸融合。2.2適宜接種密度的確定隨接種密度的增大,吸光度值逐漸增大;以1×109L-1密度接種時吸光度值最大,活細(xì)胞數(shù)量最多,細(xì)胞活性較好,故以1×109L-1為適宜接種密度,進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng),見圖2。2.3細(xì)胞增殖速度隨細(xì)胞次數(shù)的變化細(xì)胞生長曲線呈S形,增殖經(jīng)過滯留期、對數(shù)生長期、平臺期3個時期,傳1代細(xì)胞增殖較快,其速度明顯快于傳4代及傳7代細(xì)胞,可見隨細(xì)胞傳代次數(shù)增多,細(xì)胞增殖速度逐漸下降,見圖3。2.4免疫熒光染色desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色:肌源性干細(xì)胞呈陽性反應(yīng),胞質(zhì)和/或胞膜被染成棕黃色,pp1～pp6細(xì)胞反應(yīng)陽性率逐漸增高,pp6細(xì)胞陽性率達(dá)90%以上,見圖4。成纖維細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。CD34,CD45,Sca-1免疫熒光染色:熒光顯微鏡下,肌源性干細(xì)胞CD34呈陽性反應(yīng),在Cy3標(biāo)記二抗作用下,發(fā)出桔紅色熒光,見圖5;CD45呈陰性反應(yīng);Sca-1呈陽性反應(yīng),在FITC標(biāo)記二抗作用下,發(fā)出黃綠色熒光,見圖6。成纖維細(xì)胞CD34,CD45,Sca-1免疫熒光染色均呈陰性反應(yīng)。3肌源性干細(xì)胞體外培養(yǎng)肌源性干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞,作為基因治療和組織工程的供體細(xì)胞,已成為治療心肌梗死、Duchenne氏肌營養(yǎng)不良等疾病的研究熱點(diǎn)[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13],近年來肌源性干細(xì)胞在治療尿失禁等方面的應(yīng)用逐步得到重視。需注意的是,肌源性干細(xì)胞主要存在于骨骼肌組織中,只是成熟組織的很少部分細(xì)胞;平時處于靜止?fàn)顟B(tài),在細(xì)胞應(yīng)激和組織缺失時才會激活;并且隨著年齡的增加,所含細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,而目前臨床疾病的治療主要是針對成體進(jìn)行。要獲得滿足臨床需要的肌源性干細(xì)胞,進(jìn)行體外篩選和擴(kuò)增后成為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)在成年大鼠中進(jìn)行,旨在探索穩(wěn)定、高效的肌源性干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。與幼齡動物相比,成體動物肌源性干細(xì)胞數(shù)量較少,分裂增殖能力相對較弱,細(xì)胞活性容易受體外條件的影響。與常用的消化酶不同,實(shí)驗(yàn)中使用XI型膠原酶,可對纖維結(jié)締組織進(jìn)行快速、充分消化,使肌肉組織松解,肌源性干細(xì)胞能夠充分釋放;Dispase是一種較溫和的細(xì)胞分離酶,對細(xì)胞損傷輕微,同時對組織進(jìn)行充分的離散,提高細(xì)胞的數(shù)量;1g/L低濃度胰酶則將細(xì)胞充分消化分離,獲得單細(xì)胞懸液,同時減少了細(xì)胞的損耗,在一定程度上提高了肌源性干細(xì)胞的數(shù)量,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了條件。實(shí)驗(yàn)對消化分離獲得的混合細(xì)胞懸液進(jìn)行密度梯度離心,將大鼠骨骼肌來源的有核細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞分離,再利用肌源性干細(xì)胞黏附力低、貼壁慢的特性,經(jīng)過有核細(xì)胞接種后的短時間多次換液,可除去高黏附性、貼壁迅速的成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等,從而得到高純度的肌源性干細(xì)胞。結(jié)果經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,pp6肌源性干細(xì)胞純度達(dá)到90%以上,且細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定,分裂增殖旺盛,擴(kuò)增能力強(qiáng)。肌源性干細(xì)胞的體外擴(kuò)增對細(xì)胞移植和干細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療至關(guān)重要。對肌源性干細(xì)胞的擴(kuò)增研究發(fā)現(xiàn),EGF、FGF-2和SCF可以通過減數(shù)分裂或促使不分裂細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂周期,從而刺激細(xì)胞增生。更重要的是,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的體外擴(kuò)增可以通過自我更新不刺激細(xì)胞分化,從而保持干細(xì)胞表型。細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)時接種密度、傳代次數(shù)及血清濃度等因素均明顯影響著細(xì)胞生長速度及活性,目前關(guān)于肌源性干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)缺乏系統(tǒng)研究。實(shí)驗(yàn)經(jīng)MTT比色法檢測了不同密度接種肌源性干細(xì)胞的細(xì)胞活性特點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)1×109L-1密度接種細(xì)胞,細(xì)胞貼壁率高,形態(tài)均勻,細(xì)胞分裂增殖速度較快、活性高,適于肌源性干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)。結(jié)果顯示傳1～4代細(xì)胞分裂增殖能力強(qiáng),生物學(xué)特性穩(wěn)定,細(xì)胞生長狀態(tài)良好,形態(tài)均勻,并逐漸呈極向性分布;而隨傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞的增殖速度變慢,形態(tài)改變,排列逐漸不規(guī)則,出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)摸索了不同培養(yǎng)條件對肌源性干細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響,總結(jié)出穩(wěn)定可靠的大鼠肌源性干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件,即采用含體積分?jǐn)?shù)為20%血清濃度的完全培養(yǎng)基,以1×109L-1密度接種傳代培養(yǎng)肌源性干細(xì)胞,傳1～4代肌源性干細(xì)胞生長狀態(tài)良好。干細(xì)胞具有多向分化能力和自我更新功能,并可表達(dá)特異性細(xì)胞標(biāo)志?；A(chǔ)研究已經(jīng)充分證實(shí)了肌源性干細(xì)胞可分化為平滑肌、脂肪、骨骼、軟骨、造血細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[21,22,23,24,25,26,27]。目前對于干細(xì)胞,包括肌源性干細(xì)胞表達(dá)的特異性細(xì)胞標(biāo)志尚無公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)。研究發(fā)現(xiàn)通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測,經(jīng)preplate技術(shù)獲得的肌源性干細(xì)胞為具有細(xì)胞表面蛋白如Sca-1和CD34的細(xì)胞亞群;值得注意的是肌源性干細(xì)胞缺乏造血干細(xì)胞標(biāo)志物,如c-kit、CD45和CD43的表達(dá)。目前認(rèn)為只有Sca-1可以穩(wěn)定的用來鑒定肌源性干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)使用肌肉特異性的結(jié)蛋白desmin來鑒定肌源性干細(xì)胞的肌源性,陽性率>90%;通過Sca-1和CD34的陽性表達(dá),鑒定了肌源性干細(xì)胞的干細(xì)胞特異性標(biāo)志;而通過CD45的陰性表達(dá),將肌源性干細(xì)胞與造血干細(xì)胞進(jìn)行了區(qū)分。認(rèn)為Sca-1,CD34,CD45和desmin組成的鑒定系統(tǒng),可以用于鑒定肌源性干細(xì)胞。MTT比色