煙草花葉病毒的誘變選育及交互保護(hù)作用研究

煙草花葉病毒的誘變選育及交互保護(hù)作用研究

由于松茸（tv）引起的卷煙花葉病是卷煙生產(chǎn)中最重要的疾病之一。利用弱勢(shì)植物保護(hù)寄生蟲避免感染同類型病毒的側(cè)支是當(dāng)前國內(nèi)外病毒防治的熱點(diǎn)之一。對(duì)于弱毒植物的獲取方法很多。除了自然過濾外，還可以通過物理因素（如輻射、熱處理）和化學(xué)因素（如亞硝酸）對(duì)強(qiáng)毒植物進(jìn)行人工誘導(dǎo)。由于mtv的自然武變率低，難以獲得弱毒植物，因此采用人工武變法可以快速實(shí)現(xiàn)突變目標(biāo)。因此，mtv弱毒植物通常采用人工誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化方法。在本實(shí)驗(yàn)中，通過處理、亞硝酸鹽誘導(dǎo)和混合處理，對(duì)vmv強(qiáng)毒株進(jìn)行誘導(dǎo)和篩選，并分析影響相互作用保護(hù)的因素。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1病毒毒源采自福建龍巖煙區(qū)的典型煙草花葉病株,經(jīng)心葉煙連續(xù)4次單斑分離后,繁殖在普通煙上.1.1.2煙臺(tái)草品種為普通煙品種(K326),由福建省大田縣煙草公司提供.1.1.3抗血小板聚集抗血清TMV普通株系的抗血清由福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所制備,用瓊脂雙擴(kuò)散法測(cè)定其效價(jià)為1∶100.1.1.4種子和消毒供試鑒別寄主植物種子部分由廈門華僑亞熱帶引種植物園徐平東博士贈(zèng)送,部分購自市場(chǎng)或采自野外.所有種子均用質(zhì)量濃度為0.1g·mL-1Na3PO4消毒后使用.1.2強(qiáng)制改變方法1.2.1病汁液接種方法以分離純化的TMV強(qiáng)毒株為材料,參照後藤忠則ら的方法,35℃熱處理15-16d.以K3PO4緩沖液(1/15mol·L-1,pH7.2)100倍稀釋(W/V)的病汁液接種心葉煙為對(duì)照.1.2.2硝酸處理參照鄭貴彬等的方法,處理10-40min.1.2.3綜合處理取35℃熱處理15d的莖部,再經(jīng)上述亞硝酸處理.1.3elisa法檢測(cè)多態(tài)性煙株中的毒株和毒株記錄小型單斑數(shù)和總斑數(shù).單斑分離參照Yehetal的方法,1個(gè)單斑接種1株普通煙.觀察20d,淘汰有表現(xiàn)癥狀的煙株,無癥狀的煙株用間接ELISA法檢測(cè).陽性反應(yīng)的植株接種心葉煙復(fù)檢,陰性反應(yīng)的植株接種強(qiáng)毒株.1.4虛弱毒癥的篩選1.4.1中毒的評(píng)估將經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)確定為帶毒但不表現(xiàn)癥狀的病株接種于心葉煙,單斑分離后接種普通煙,并觀察其癥狀表現(xiàn),以同樣方法連續(xù)接種4代.1.4.2接種葉和系統(tǒng)葉參考覃秉益等方法,稍作修改.接種弱毒株時(shí),第1次接種后隔10min左右重接1次.接種14d后用間接ELISA法檢測(cè)植物的接種葉和系統(tǒng)葉,檢測(cè)為陽性的植株繼續(xù)觀察癥狀的表現(xiàn).1.5接種前和接種后取樣強(qiáng)、弱毒株分別接種團(tuán)棵期普通煙的第4葉位葉片,各重復(fù)3株.弱毒株接種方法同1.4.2.分別于接種前及接種1d后開始取樣.接種部位包括接種葉和接種葉的上3位葉.取樣方法:用直徑為8mm的打孔器在重復(fù)的3株上各取1圓片,將3個(gè)圓片合在一起稱重,按1∶10(W/V)加入包被緩沖液,-20℃保存,最后用間接ELISA法檢測(cè).1.6強(qiáng)、弱毒株增殖速率的測(cè)定采用正交設(shè)計(jì)法,以L9(34)方案安排試驗(yàn),每組重復(fù)10株.考察因素包括弱、強(qiáng)毒株接種濃度,接種間隔時(shí)間,強(qiáng)毒株的接種部位及煙株生育期等.強(qiáng)、弱毒株的病葉分別用K3PO4緩沖液(0.1mol·L-1,pH7.2)100倍稀釋(W/V),接種心葉煙,測(cè)定枯斑數(shù),確定強(qiáng)、弱毒株的接種濃度.取強(qiáng)毒株濃度高于弱毒株濃度,強(qiáng)、弱毒株濃度相同及強(qiáng)毒株濃度低于弱毒株濃度3個(gè)位級(jí).煙株生育期分為幼苗期、團(tuán)棵期及成熟期.根據(jù)強(qiáng)、弱毒株增殖速率的測(cè)定結(jié)果,確定弱、強(qiáng)毒株的接種間隔時(shí)間,取弱毒株處于潛伏期、弱毒株增殖并輸送到系統(tǒng)葉上及弱毒株在煙草植株中充分?jǐn)U展這3個(gè)時(shí)間段.強(qiáng)毒株接種部位分別為弱毒株接種葉的上位葉、接種葉及下位葉.觀察癥狀,接種強(qiáng)毒株30d后記錄結(jié)果,統(tǒng)計(jì)病株率.2結(jié)果與分析2.1小型枯斑的誘變效果TMV的強(qiáng)毒株與弱毒株在心葉煙上可出現(xiàn)2種不完全相同的枯斑,前者為大型淡色枯斑,后者為小型枯斑,故以小型枯斑作為突變成弱毒株的標(biāo)志,誘變結(jié)果見表1.未經(jīng)誘變劑處理的N1/N2值為0.803;而35℃熱處理、亞硝酸處理及復(fù)合處理的N1/N2值都有所提高,說明3種誘變處理都可以有效提高突變頻率;而復(fù)合處理的N1/N2值與對(duì)照相比提高顯著,較單獨(dú)處理也有明顯的提高,說明復(fù)合處理具有較好的協(xié)同效應(yīng).2.2虛弱毒癥的篩選2.2.1帶毒煙草植株的篩選單斑分離共接種了258株煙苗,20d后淘汰37株有表現(xiàn)癥狀的煙苗.用間接ELISA法檢測(cè)不表現(xiàn)癥狀的煙苗,其中17株為陽性反應(yīng),15株陸續(xù)出現(xiàn)癥狀,只有代號(hào)為017、022的2個(gè)突變株表現(xiàn)相當(dāng)穩(wěn)定,即不表現(xiàn)癥狀.以間接ELISA法檢測(cè)為陰性的煙苗接種強(qiáng)毒株,發(fā)現(xiàn)有1株連續(xù)2次均不表現(xiàn)癥狀,將其接種于心葉煙,有枯斑產(chǎn)生,其標(biāo)號(hào)為152.選定標(biāo)號(hào)為017、022、152的3個(gè)變異株進(jìn)行毒力鑒定.連續(xù)反復(fù)接種心葉煙及普通煙4次,觀察普通煙表現(xiàn)的癥狀,結(jié)果見表2.017和152連續(xù)4代在普通煙上均不表現(xiàn)癥狀,表明這2株的弱毒性穩(wěn)定.而022的4代剛開始時(shí)均不表現(xiàn)癥狀,到后期(至少接種30d后)出現(xiàn)輕微花葉癥狀,表明其弱毒性不穩(wěn)定.從而獲得2株穩(wěn)定的弱毒株,記為TMV-017(35℃熱處理15d)及TMV-152(復(fù)合處理20min).2個(gè)突變株的帶毒煙草植株與正常植株外觀上無顯著區(qū)別.因此熱處理和復(fù)合處理均獲得了穩(wěn)定的弱毒株.2.2.2供試植物的篩選強(qiáng)、弱毒株共接種17科50種植物,包括茄科的辣椒、普通煙、白肋煙、心葉煙、三生煙、洋酸漿、番茄、龍葵、枯斑三生煙、蔓陀蘿,豆科的綠豆、豌豆、花生、蠶豆、大豆、赤豆、豇豆、菜豆、菜豆(pinto),十字花科的白蘿卜、包菜、花椰菜、青菜、芥菜、油菜,葫蘆科的苦瓜、絞股藍(lán)、絲瓜、甜瓜、黃瓜,車前科的大車前,菊科的蒼耳、萵苣、馬蘭、野菊花,藜科的莧色藜,莧科的千日紅、莧菜,紫茉莉科的紫茉莉,禾本科的玉米,旋花科的空心菜、甘薯、裂葉牽牛,鳳仙花科的鳳仙花,傘形科的芹菜,番木瓜科的番木瓜,商陸科的商陸,唇形科的紫蘇,夾竹桃科的長春花.接種后的癥狀觀察和間接ELISA法檢測(cè)表明:在供試植物中,強(qiáng)、弱毒株主要侵染4科13種植物,在心葉煙、曼陀羅、枯斑三生煙、菜豆(pinto)、莧色藜、千日紅的接種葉上均為局部壞死斑.強(qiáng)毒株在辣椒、普通煙、洋酸漿、三生煙、龍葵、白肋煙、番茄上為系統(tǒng)侵染,呈花葉癥狀,而TMV-017和TMV-152能侵染,但沒有可見的癥狀.表明篩選得到的弱毒株并未擴(kuò)大寄主范圍,弱毒株的應(yīng)用在這些植物上是安全的.2.3穩(wěn)定性檢測(cè)所用弱毒株為TMV-152.在接種葉上強(qiáng)毒株的陰性對(duì)照D(405nm)值為0.113,弱毒株TMV-152的陰性對(duì)照D(405nm)值為0.186(表3).采用ELISA方法檢測(cè)病毒時(shí),D(405nm)值/陰性D(405nm)值≥2,則判定檢測(cè)結(jié)果為陽性.由表3可知:強(qiáng)毒株在接種后第2天該比值為4.894,而弱毒株在接種后第4天該比值為3.699,故為陽性反應(yīng),表明強(qiáng)毒株的增殖速率比弱毒株快.強(qiáng)毒株的比值穩(wěn)定在8左右,而弱毒株的比值則遠(yuǎn)低于8,表明強(qiáng)毒株在煙草植株體內(nèi)的濃度比弱毒株的高.在系統(tǒng)葉上,強(qiáng)毒株的陰性D(405)值為0.111,弱毒株(TMV-152)的陰性D(405nm)值為0.185(表4).由表3可知,強(qiáng)毒株在接種后第4天比值達(dá)到3.694,而弱毒株則在第5天達(dá)到2.222,故為陽性反應(yīng),表明強(qiáng)、弱毒株均已擴(kuò)展到系統(tǒng)葉上.從接種葉和系統(tǒng)葉上的增殖速率看,弱毒株在煙草植株體內(nèi)的運(yùn)輸并未受到影響.2.4團(tuán)株期和接種間隔時(shí)間所用弱毒株為TMV-152.強(qiáng)、弱毒株分別接種心葉煙,枯斑數(shù)相差3倍,因而確定弱、強(qiáng)毒株接種濃度分(1/10,1/10)、(1/10,1/40)、(1/10,1/160)3個(gè)位級(jí).弱、強(qiáng)毒株接種間隔時(shí)間分別取1、6、17d3個(gè)位級(jí),4個(gè)因素的3個(gè)位級(jí)見表5.用L9(34)正交表安排試驗(yàn),結(jié)果見表6.從表7可知,考察的4個(gè)因素中,強(qiáng)、弱毒株接種間隔時(shí)間的極差(R)最大,表明它們是影響弱毒株保護(hù)作用的最重要因素.在團(tuán)棵期,弱、強(qiáng)毒株接種間隔時(shí)間為17d,保護(hù)效果最佳(病株率為0).3討論3.1tmv弱毒株的獲得植物病毒的變異機(jī)制有許多種,但自然突變率通常很低.一般而言,采用自然分離的方法也可以獲得弱毒株,但并非對(duì)所有的病毒都適用.采用人工誘變處理,可大大提高突變頻率,從而獲得理想的弱毒株.人工誘變方法很多,可根據(jù)誘變劑的作用機(jī)理加以選擇.在誘變育種中,經(jīng)常應(yīng)用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng).在獲得TMV弱毒株的方法上,前人大多采用單種誘變處理.Holmes通過熱處理獲得弱毒株TMV-M;日本大島通過熱處理TMV,在番茄上經(jīng)4代繁殖得到L11A弱毒株,并已在日本大規(guī)模推廣應(yīng)用,保護(hù)番茄免受TMV強(qiáng)毒株的危害,獲得增產(chǎn)15%-30%的保護(hù)效果;荷蘭學(xué)者Rast用亞硝酸誘變TMV番茄株系獲得MⅡ-16弱毒株;日本學(xué)者後藤中則ら采用熱處理TMV辣椒株系,獲得弱毒株P(guān)a18;張秀華等用亞硝酸誘變獲得2株TMV弱毒株(N11和N14);鄭貴彬等采用亞硝酸誘變,獲得TMV弱毒株(DN60-3).結(jié)果表明,采用熱空氣和亞硝酸的復(fù)合處理可顯著提高有效突變頻率,且優(yōu)于單種誘變處理,因而可增加獲得弱毒株的機(jī)率.要確定一個(gè)合適的誘變劑量,常常要經(jīng)過多次試驗(yàn).單獨(dú)使用的適宜劑量對(duì)復(fù)合處理來說不一定是最適宜的劑量.如對(duì)提高突變頻率來說,亞硝酸處理最適劑量的時(shí)間為40min或更長,但是復(fù)合處理最適劑量的時(shí)間為10min或更短.3.2tmv突變株的篩選及鑒定雖然使用誘變劑可提高突變頻率,但是有效的突變頻率還是相對(duì)較低的,因而通過誘變處理接種心葉煙后要盡可能多地進(jìn)行單斑分離.采用一種靈敏度高、檢測(cè)量大、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法即間接ELISA法,就能滿足這些要求,但其出現(xiàn)假陽性的機(jī)率較高.出現(xiàn)陽性反應(yīng)的應(yīng)再用生物學(xué)方法(如接種單斑寄主)進(jìn)行復(fù)檢,出現(xiàn)陰性反應(yīng)的也可用生物學(xué)方法確證.在本實(shí)驗(yàn)中,用間接ELISA法檢測(cè),TMV-152株為陰性,但2次接種強(qiáng)毒株后都不表現(xiàn)癥狀,最后用心葉煙檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有枯斑產(chǎn)生,可能是剛開始檢測(cè)時(shí)TMV-152株的濃度較低的原因.弱毒株的弱毒性能否穩(wěn)定以及對(duì)其它植物是否產(chǎn)生危害是在應(yīng)用弱毒株防治病毒病之前需要考察的內(nèi)容.我們篩選到的弱毒株經(jīng)4次毒力鑒定發(fā)現(xiàn),有2株弱毒性穩(wěn)定,且在可以系統(tǒng)侵染的植物上無癥狀,這為使用弱毒株提供了安全保障.但是弱毒株應(yīng)用到田間后,弱毒性能否穩(wěn)定,還有待于進(jìn)一步觀察.一般地,弱毒株的增殖速率比強(qiáng)毒株慢,濃度也較低,我們得到的弱毒株也是如此,這與發(fā)生突變的位點(diǎn)有關(guān),可通過對(duì)TMV突變株的核苷酸序列測(cè)定,得到確認(rèn).而弱毒株的交互保護(hù)作用與弱毒株的增殖速率成正相關(guān),因而在篩選弱毒株時(shí)也要把增殖速率作為一個(gè)指標(biāo).同時(shí)在接種弱毒株時(shí),要采取相應(yīng)的接種方法,必要時(shí)還可采用血清學(xué)方法檢測(cè),以確保接種成功.3.3接種間隔時(shí)間及苗期Mckinney發(fā)現(xiàn)植物病毒株系間存在著干擾現(xiàn)象,Kunkel提出利用弱毒株預(yù)防強(qiáng)毒株侵染的設(shè)想,Holmes通過熱處理獲得TMV弱毒株,并首次報(bào)道了利用弱毒株防治番茄花葉病的效果,之后,許多國家都進(jìn)行了利用弱病毒防治植物病毒病害的研究.到目前為止,已有多種植物病毒的弱毒疫苗研制成功,并已開始小面積推廣試驗(yàn)工作.關(guān)于弱毒株的交互保護(hù)作用機(jī)理在50年代就有過種種推測(cè),也出現(xiàn)了一些假說,但直到目前還無定論.本實(shí)驗(yàn)考察的4個(gè)因素中,弱、強(qiáng)毒株接種間隔時(shí)間是影響弱毒株保護(hù)作用的重要因素之一.在接種間隔時(shí)間為1d(弱毒株增殖還處于潛伏期)、6d(弱毒株已增殖到一定程度,且已運(yùn)輸?shù)较到y(tǒng)葉)、17d(弱毒株在植株體內(nèi)較充分?jǐn)U展)時(shí),不管煙苗處于哪個(gè)生長階段以及強(qiáng)毒株的接種部位如何,以17d的保護(hù)作用為最好,其它組合效果不佳.這說明弱毒株在增殖到一定程度并在植株體內(nèi)充分?jǐn)U展后,保護(hù)作用才能達(dá)到較高水平,這與其他人的結(jié)論相符.苗期也是一個(gè)重要的因素,在旺長期,弱毒株的交互保護(hù)作用最好,這為弱毒株在田間的應(yīng)用提供了理論依據(jù),也為探討弱毒株的保護(hù)作用機(jī)理提供了素材.弱毒株在植株體內(nèi)能否保持穩(wěn)定的濃度以及接種間隔時(shí)間如何影響保護(hù)作用,還有待于進(jìn)一步研究.有多種因素影響弱毒株的保護(hù)作用,如作物品種,溫度,強(qiáng)、弱毒株接種間隔時(shí)間及苗期等.本文嘗試采用正交設(shè)計(jì)方法來考察這4個(gè)因素對(duì)弱毒株保護(hù)作用的影響,得出的結(jié)果與其他方法相似,說明這