維生素C生產(chǎn)工藝綜述

維生素C生產(chǎn)工藝綜述摘要:介紹了維生素C的性質(zhì)、功效和用途。綜述了維生素C生產(chǎn)技術(shù)的演變過程和發(fā)展趨勢(shì)。著重探討了微生物發(fā)酵法的生產(chǎn)工藝進(jìn)展。介紹了二步發(fā)酵法的研發(fā)現(xiàn)狀,探討了2-酮基-L-古龍酸的分離提取工藝。展望了我國(guó)維生素C生產(chǎn)技術(shù)的前景。核心詞:維生素C,功效,二步發(fā)酵法,發(fā)酵,2-酮基-L—古龍酸,分離提取TheOverviewontheProductionProcessofVitaminCAbstract:Characters,functionsandusesofvitaminCareintroduced.DevelopmentalprocessandtrendofindustrialtechnologyonvitaminCarereviewed.Advancesinindustrialtechnologyofmicrobiologicalfermentationmethodarediscussedemphatically.AfterpresentsituationofR&Dofthetwostepsfermentationmethodisintroduced,theseparationandpurificationprocessesof2-keto-L-gluconicacidarediscussed.ThedirectionofindustrialtechnologyonvitaminCinChinaispreviewed.Keywords:VitaminC,Function,Twostepsfermentationmethod,Fermentation,2-keto-L-gluconicacid,Separationandextraction維生素C(vitaminC,下列簡(jiǎn)稱Vc)又名L-抗壞血酸(L-ascorbicacid),是一種人體必需的水溶性維生素。Vc廣泛存在于生物組織中,在新鮮水果、蔬菜和動(dòng)物肝臟等中的含量尤為豐富。綠色植物能夠自己合成Vc,而人和許多動(dòng)物由于肝臟中缺少一種古洛內(nèi)酯氧化酶,因而不能自己合成,必須從外界攝取。1.維生素C的性質(zhì)、功效和用途性質(zhì)純維生素C在常溫下為無色晶體,味酸,易溶于水。Vc在結(jié)晶狀態(tài)尚穩(wěn)定,而在水溶液中則很不穩(wěn)定,容易為加熱、氧化所破壞。L-抗壞血酸含有較強(qiáng)的還原性,在體內(nèi)經(jīng)抗壞血酸氧化酶的作用可脫氫氧化成L-脫氫抗壞血酸,該脫氫反映是一種可逆反映。還原型的L-抗壞血酸和氧化型的L-脫氫抗壞血酸均含有生理活性,它們構(gòu)成的一對(duì)氧化-還原系統(tǒng),在細(xì)胞代謝中起著重要的生理作用[1]。功效與用途Vc在人體中含有廣泛的生理作用:1)參加體內(nèi)氧化還原反映[2];2)對(duì)抗自由基損傷[3];3)改善機(jī)體免疫功效[4];4)參加膠原蛋白和細(xì)胞間質(zhì)的合成[2];5)參加神經(jīng)遞質(zhì)的合成[2];6)參加氨基酸代謝與鐵代謝[2];7)克制血小板及白細(xì)胞活化[2];等等。因此,Vc在壞血病[5]、感冒、心血管缺點(diǎn)、高膽固醇、糖尿病、精神抑郁癥[6]、危重型克山病等疾病的臨床治療中均含有重要的用途。另外,Vc還能夠用作食品添加劑、飼料添加劑、某些農(nóng)作物的催熟劑、化妝品工業(yè)防銹劑[6],等等。的生產(chǎn)辦法萊氏法萊氏法是1933年德國(guó)化學(xué)家Reichstein等發(fā)明的最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)VC的辦法。該法以葡萄糖為原料,經(jīng)催化加氫制取D-山梨醇,然后用醋酸菌發(fā)酵生成L-山梨糖,再經(jīng)酮化和化學(xué)氧化,水解后得到2-酮基-L-古洛糖酸(2-KLG),再經(jīng)鹽酸酸化得到VC。萊氏法生產(chǎn)的VC產(chǎn)品質(zhì)量好、收率高。由于生產(chǎn)原料便宜易得,中間產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,至今仍是許多國(guó)外VC生產(chǎn)商,如Roche公司、BASF/Takeda公司和E.Merck公司等廠商采用的重要工藝辦法。但是萊氏法也存在不少缺點(diǎn),諸如生產(chǎn)工序多、勞動(dòng)強(qiáng)度較大,使用大量有毒、易燃化學(xué)藥品,容易造成環(huán)境污染等。為此,自20世紀(jì)60年代起,各國(guó)學(xué)者始終致力于萊氏法的改善。其過程如圖1所示：H2/Ni醋酸桿菌丙酮/H2SO4D-葡萄糖D-山梨醇L-山梨糖雙丙酮-L-山梨糖高壓[O]水解化學(xué)轉(zhuǎn)化雙丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸2-KLCVcNiSO4圖1萊氏法生產(chǎn)Vc的工藝流程二步發(fā)酵法我國(guó)的混合菌發(fā)酵工藝是20世紀(jì)70年代由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和北京制藥廠共同建立的，涉及2個(gè)發(fā)酵環(huán)節(jié)，故稱兩步發(fā)酵法。第一步是在醋酸桿菌作用下將D－山梨醇氧化為L(zhǎng)－山梨糖，俗稱醇糖轉(zhuǎn)化，現(xiàn)在國(guó)外對(duì)其有關(guān)基因和轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究已經(jīng)比較清晰；第二步是在一種混合菌系的作用下將L－山梨糖進(jìn)一步氧化為KGA，俗稱糖酸轉(zhuǎn)化[7]。上述混合菌系涉及2種微生物，直接負(fù)責(zé)山梨糖生物氧化的微生物俗稱小菌，最初曾被鑒定為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans），近來Urbance等[8]經(jīng)系統(tǒng)分類學(xué)鑒定對(duì)其重新命名為普通酮古龍酸菌（Ketogulonigeniumvulgare）。另一種微生物俗稱大菌，本身不能轉(zhuǎn)化山梨糖，作為伴生菌起到輔助小菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的作用。許多微生物含有這種伴生菌的作用，生產(chǎn)中慣用的有臘狀芽孢桿菌（Bacilluscereus）、巨大芽孢桿菌（B．megaterium）、蘇蕓金芽孢桿菌（B．thuringiensis）等?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)Vc生產(chǎn)廠家都采用混合菌發(fā)酵法，該法是惟一成功應(yīng)用于大規(guī)模Vc工業(yè)生產(chǎn)的微生物轉(zhuǎn)化法，含有糖酸轉(zhuǎn)化效率高的突出優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)在我國(guó)Vc生產(chǎn)規(guī)模占世界總生產(chǎn)規(guī)模的2／3，其中80％的產(chǎn)品用于出口，是我國(guó)醫(yī)藥領(lǐng)域的支柱產(chǎn)業(yè)?；旌暇l(fā)酵法在國(guó)內(nèi)的成功應(yīng)用也引發(fā)了國(guó)外的廣泛關(guān)注。1986年，我國(guó)的兩步發(fā)酵法向瑞士HoffmannLa－Roche公司進(jìn)行了技術(shù)轉(zhuǎn)讓。其過程如圖2所示：H2/Cat醋酸桿菌大菌、小菌D-葡萄糖D-山梨醇D-山梨糖2–KLG混合發(fā)酵化學(xué)轉(zhuǎn)化Vc圖2二步發(fā)酵法生產(chǎn)Vc的工藝流程大、小菌關(guān)系的研究進(jìn)展二步發(fā)酵法中的第二步發(fā)酵是由氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans）和巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）混合發(fā)酵完畢的，前者為產(chǎn)酸菌俗稱小菌，但單獨(dú)培養(yǎng)傳代存活率及產(chǎn)酸能力較低。后者為伴生菌俗稱大菌，它不產(chǎn)酸，混合培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)酸顯著提高。混合發(fā)酵中大小菌兩者關(guān)系復(fù)雜，始終是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。魏東芝[9]曾提出大菌為小菌提供某種生長(zhǎng)因子增進(jìn)小菌生長(zhǎng)的構(gòu)想。馮樹等[10]研究證明，大菌胞內(nèi)液和胞外液均可增進(jìn)小菌生長(zhǎng)，大菌胞外液中含有該作用的組分分子量在100kDa以上；大菌胞外液含有增進(jìn)小菌產(chǎn)酸，其胞內(nèi)液無該作用；大菌胞外液中含有該活性作用的組分為30-50kDa和不不大于100kDa兩個(gè)部分。其中前者是一種含鐵和鋅的蛋白質(zhì)，該活性蛋白的形成規(guī)律和作用機(jī)制尚在探索中。焦迎暉[11]等通過分析Vc二步發(fā)酵過程中活菌產(chǎn)酸量、糖酸轉(zhuǎn)化活力等，證明了大菌的胞外液或胞內(nèi)液對(duì)小菌休止細(xì)胞的糖酸轉(zhuǎn)化活力并沒有直接影響，即大菌的作用僅僅是增進(jìn)小菌的生長(zhǎng)，而對(duì)產(chǎn)酸的增進(jìn)作用是因使小菌密度提高的成果?，F(xiàn)在，大、小菌的具體混生機(jī)制尚未完全明了，仍需人們進(jìn)一步探索。菌種選育的研究有關(guān)二步發(fā)酵法中的第二步發(fā)酵過程的菌種選育始終是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C研究的熱點(diǎn)課題之一，我國(guó)學(xué)者作了大量的工作。尹光琳等[7]采用紫外照射、化學(xué)誘變和原生質(zhì)體融合等辦法選育得到的新組合菌系SCB329—SCB933的發(fā)酵周期僅40—50h，產(chǎn)酸達(dá)115—130mg/mL，轉(zhuǎn)化率約為90%。焦鵬等[12]運(yùn)用SMA探針技術(shù)HB—HG影印技術(shù)篩選得到了一株蛭弧菌J26，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生2—KLG的發(fā)酵單位為50—60mg/mL。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，該菌株的發(fā)酵單位已達(dá)成%—%。許安等[13]運(yùn)用離子注入技術(shù)選育出的2—KLG高產(chǎn)菌系IPPM—1028，其轉(zhuǎn)化率較出發(fā)菌M—2980提高%，發(fā)酵周期為60—64h，2—KLG濃度可達(dá)70mg/mL左右，轉(zhuǎn)化率為95%。李越中[6]采用含pUB110質(zhì)粒的小菌轉(zhuǎn)化子（KmrSts）與Q132（KmsStr）大菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，獲得可持續(xù)傳代10代以上的小菌，這將為實(shí)現(xiàn)小菌的單獨(dú)培養(yǎng)以及對(duì)小菌的遺傳學(xué)研究打下基礎(chǔ)。陳建華等[14]用配對(duì)法篩選得一株氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans）10—3的優(yōu)良伴生菌短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）97002,L—山梨糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)90%左右。初步嘗試兩菌屬間原生質(zhì)體融合。盡管有關(guān)二步發(fā)酵法第二步發(fā)酵過程的菌種選育的研究進(jìn)行了諸多，但仍處在實(shí)驗(yàn)室研究或小試階段。發(fā)酵工藝條件的研究微生物發(fā)酵是一種極其復(fù)雜的生化反映過程。基質(zhì)濃度、溫度、PH等因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成都會(huì)產(chǎn)生直接影響。國(guó)內(nèi)某些學(xué)者對(duì)二步發(fā)酵法工藝進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。魏東芝等[9]研究了VC二步發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)，通過測(cè)定發(fā)酵中大小菌生長(zhǎng)規(guī)律及基質(zhì)和產(chǎn)物的變化，建立了簡(jiǎn)化的動(dòng)力學(xué)模型，在一定程度上揭示了2KLG發(fā)酵系統(tǒng)的本質(zhì)特性，為分析發(fā)酵過程，指導(dǎo)生產(chǎn)及實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)持續(xù)自動(dòng)化奠定了基礎(chǔ)。張忠澤[15]等通過優(yōu)化通氣、溫度和金屬離子等環(huán)境因子，顯著改善了二菌協(xié)同共生效果，醇酸轉(zhuǎn)化率提高了%，發(fā)酵周期縮短了。針對(duì)L—山梨糖濃度不高的問題，尹光琳等[7]通過對(duì)新組合菌系SCB329—SCB933批加L—山梨糖技術(shù)的研究，既避免了高糖對(duì)菌體生長(zhǎng)的克制作用，又能運(yùn)用菌株的優(yōu)良特性，使底物濃度提高到14%?？祵W(xué)真[16]等通過對(duì)VC二步發(fā)酵中大小菌的比例對(duì)產(chǎn)酸的影響，測(cè)定和分析了零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)種子的生長(zhǎng)曲線，得出了各級(jí)種子的最適培養(yǎng)時(shí)間、零級(jí)種子培養(yǎng)最初接種量及大小菌的接種比例，對(duì)實(shí)踐有指導(dǎo)作用。蔣宇揚(yáng)、張成剛[17]研制了幾個(gè)稀土元素化合物，考察了它們對(duì)2—酮基L—古龍酸還原酶（KGR）及在L—山梨糖發(fā)酵中對(duì)2—KLG產(chǎn)酸的影響，搖瓶實(shí)驗(yàn)成果表明，在L—山梨糖發(fā)酵中加入稀土元素化合物，發(fā)酵時(shí)間縮短6h，2—KLG產(chǎn)酸量提高超出6mg/mL。李越中[6]采用聚乙烯/海藻酸鈣包埋對(duì)大、小菌進(jìn)行固定化，獲得高于游離菌的產(chǎn)酸量；并采用種子液活化的辦法使固定化細(xì)胞半衰期延長(zhǎng)至10批次。提取工藝二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵后來,發(fā)酵液中僅含8%左右的2-KLG,而殘留菌絲體、蛋白質(zhì)、多糖或懸浮微粒等雜質(zhì)的含量卻很高。這給2-KLG的分離提純帶來了很大困難,致使后解決費(fèi)用占總成本的比例較大?，F(xiàn)在,VC工業(yè)生產(chǎn)中慣用的2-KLG的分離提純辦法有加熱沉淀法、化學(xué)凝聚法和超濾法。(1)加熱沉淀法加熱沉淀法是2-KLG分離提純的傳統(tǒng)工藝,分離手段較為落后。此工藝通用氫型樹脂,調(diào)pH至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)后加熱除蛋白。采用此工藝會(huì)造成有效成分在高溫下降解損失,且發(fā)酵液直接通過樹脂柱,造成樹脂表面污染,減少樹脂的交換容量和收率。兩次通過樹脂柱帶進(jìn)了大量水分,也增大了濃縮耗能。(2)化學(xué)凝聚法化學(xué)凝聚法是通過加入化學(xué)絮凝劑來除去蛋白質(zhì)、菌體、色素等雜質(zhì),避免了加熱沉淀時(shí)有效成分的損失。季光輝等[18]采用化學(xué)凝聚法對(duì)VC發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)解決,使2-KLG的濾液質(zhì)量提高,提取前步收率提高5.2%,VC總收率提高2.5%以上。陳雷等[19]以殼聚糖為主凝劑,聚丙烯酰胺為助凝劑,通過化學(xué)凝聚法除蛋白工藝,提取收率由原來的76%提高到82%,古龍酸優(yōu)級(jí)品率由原來的35%提高到60%,成本比原來減少20%。但是,化學(xué)凝聚法也存在局限性,重要體現(xiàn)在解決后的發(fā)酵液離心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白,如發(fā)酵液染菌則解決的效果更不明顯,上清液渾濁,嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量和收率。另外,所用的化學(xué)絮凝劑也可能對(duì)環(huán)境造成污染。(3)超濾法超濾是一種新興的膜解決技術(shù),此法含有操作方便、節(jié)能、不造成新的環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn),因此在2-KLG的分離提純中的應(yīng)用日益廣泛[20]。此法與加熱沉淀法不同的是,可在常溫下操作,可減少有效成分的損失;在用膜除蛋白的過程中,無任何新的化學(xué)物質(zhì)加入,可減少對(duì)樹脂的污染和損耗,減少酸堿用量,減少三廢排放。與化學(xué)凝聚法不同的是,在解決染菌的發(fā)酵液時(shí)仍可達(dá)成較好的解決效果。我國(guó)的東北制藥廠1995年從丹麥引進(jìn)現(xiàn)在全國(guó)最大膜面積的平板超濾裝置后,2-KLG的分離提純成本比原先的化學(xué)凝聚法節(jié)省了600萬元,其收率和生產(chǎn)的自動(dòng)化、持續(xù)化程度也明顯提高[21]。隨著新型膜材料技術(shù)的開發(fā),如陶瓷膜、不銹鋼膜等的應(yīng)用,超濾法的應(yīng)用效果會(huì)有進(jìn)一步的提高。同時(shí),國(guó)內(nèi)外正在探索反滲入、納濾等后序解決新工藝的應(yīng)用,以完善工藝聯(lián)結(jié)[22]。(4)其它辦法除上述三種辦法外,現(xiàn)在尚有仍處在小試階段的離子交換法和溶媒萃取法的研究報(bào)道。劉坐鎮(zhèn)等[23]用離子交換法對(duì)發(fā)酵液中2-KLG的提取工藝進(jìn)行了研究,系統(tǒng)考察了四種大孔弱堿性陰離子交換樹脂對(duì)2-KLG的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能以及影響因素,并對(duì)洗脫條件進(jìn)行了探索。錢衛(wèi)國(guó)等[24]對(duì)溶媒萃取法的提取工藝進(jìn)行了初步研究,篩選出了較為適宜的萃取劑、稀釋劑、助萃劑和反萃劑,考察了pH值、無機(jī)酸和相比對(duì)萃取性能的影響,并對(duì)三級(jí)逆流萃取過程進(jìn)行了串聯(lián)模擬。轉(zhuǎn)化工藝無論是萊氏法還是二步發(fā)酵法制得的2-KLG,現(xiàn)在在生產(chǎn)上都是通過化學(xué)反映過程轉(zhuǎn)化為VC。根據(jù)所選試劑的不同,二步發(fā)酵法可分為酸轉(zhuǎn)化法和堿轉(zhuǎn)化法[25]。(1)酸轉(zhuǎn)化法VC化學(xué)轉(zhuǎn)化生產(chǎn),自萊氏法建立以來就采用濃鹽酸催化2-KLG,一步制得VC。國(guó)外有關(guān)學(xué)者對(duì)此法進(jìn)行了許多研究。印度AhmedbadTextile工業(yè)研究協(xié)會(huì)研究表明,在以飽和氯代烴(如CHCl3)、芳烴(如苯、甲苯)為溶劑,由2-KLG與濃鹽酸在60～75℃下反映4～6h,可制得純度為90%的粗VC[26]。美國(guó)學(xué)者YODICE等[27]于1985年報(bào)道了2-KLG與濃鹽酸在表面活性劑Me(CH2)5N+Me3Cl的甲苯溶液中反映,可制得純度超出99%的VC。近年來,有關(guān)一步酸轉(zhuǎn)化法制VC的研究報(bào)道更是層出不窮。1999年,美國(guó)有關(guān)專利指出,在氧化鈷為催化劑的體系中,2-KLG與足量的次氯酸反映可制得高純度的VC[28]。,德國(guó)學(xué)者FECHTEL等[29]報(bào)道了2-KLG與濃鹽酸在4.5Mpa的高壓釜中于42℃反映3h,可制得VC,收率高達(dá)95%。酸轉(zhuǎn)化法工藝簡(jiǎn)樸,操作環(huán)節(jié)少,但反映過程中選用濃鹽酸對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重。另外,由于在反映體系中引入了惰性溶劑或表面活性劑,使后期的分離造成不便。(2)堿轉(zhuǎn)化法我國(guó)VC生產(chǎn)廠家均采用堿法轉(zhuǎn)化2-KLG生產(chǎn)VC。東北制藥總廠等生產(chǎn)單位將2-KLG與甲醇在濃硫酸催化下生成2-酮基-L-古龍酸甲酯,該酯在NaHCO3作用下發(fā)生內(nèi)酯化反映生成VC鈉鹽。該法避免了酸催化的上述缺點(diǎn),且操作工藝簡(jiǎn)樸,反映條件溫和,適合于規(guī)?；a(chǎn),但是在生產(chǎn)中的反映周期過長(zhǎng),甲醇單耗高[30]。有些單位嘗試用CH3ONa替代NaHCO3進(jìn)行堿轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率可高達(dá)92.6%,但產(chǎn)品質(zhì)量較差,且甲醇鈉價(jià)格貴,造成生產(chǎn)成本較高[31]。國(guó)外學(xué)者對(duì)堿轉(zhuǎn)化的研究也始終在進(jìn)行。Bottcher等[32]用丁醇替代甲醇,采用濃硫酸催化,在真空度0.02MPa、85℃的條件下與2-KLG進(jìn)行反映,2h后蒸去多出的丁醇及生成的水,向反映體系中加入氯乙烯和鹽酸,在72～75℃加熱17h,過濾后得到純度為98%的VC。Veits[33]用離子交換樹脂作催化劑,使2-KLG與甲醇的反映液于80℃下在樹脂柱中停留10～120min,然后將酯化液與NaHCO3作用得到純度為98%的粗VC鈉鹽。美國(guó)Fastman化學(xué)公司的研究人員將模擬流動(dòng)床(SMB)反映器應(yīng)用于該酯化反映,通過SMB反映器脫水以增進(jìn)酯化反映的進(jìn)行[34]。Oklobdzu等[35]通過二步酯化過程增進(jìn)酯化反映的進(jìn)行,有效地實(shí)現(xiàn)了分離反映產(chǎn)物和反映過程中生成的水。由VC鈉鹽制備VC所采用的重要辦法是硫酸酸化法和樹脂交換法[36]。硫酸酸化法操作簡(jiǎn)樸,但需妥善控制甲醇的濃度和pH值,才干使硫酸鈉與VC得以分離。氫型離子樹脂交換法設(shè)備龐大,操作復(fù)雜,且需經(jīng)常再生樹脂,增加了酸耗,酸液大量排放容易對(duì)環(huán)境造成威脅?，F(xiàn)在,人們正在主動(dòng)探索使用雙極性膜(BipolarMembraneElectrodial2ysis,BME)來替代傳統(tǒng)的酸化工藝[37～39],其工作原理為:在直流電場(chǎng)作用下,雙極性膜中的水被離解成H+和OH-,H+替代VC鈉鹽中的Na+結(jié)合成離解度小的VC,原VC鈉鹽中的Na+在電場(chǎng)的作用下通過陽離子交換膜從VC鈉鹽中分離出來,并和OH-結(jié)合生成NaOH。雙極性膜電滲析法無需外加物料可將VC鈉鹽轉(zhuǎn)化成VC,過程簡(jiǎn)樸,能耗低,投資少,轉(zhuǎn)化率高,其副產(chǎn)品和NaOH稀溶液也可被有效運(yùn)用,對(duì)環(huán)境無污染,有望應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。新二步發(fā)酵法新二步發(fā)酵法最先是由日本鹽野義制藥公司園天高康等發(fā)明的，也稱葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵法[40]，其工藝流程如圖3所示。歐文氏菌幫桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化D-葡萄糖2,5–DKG2-KLGVc圖3新二步發(fā)酵法工藝流程園天高康等[41]用歐文氏菌SHS突變株和棒狀桿菌SHS的突變株進(jìn)行10t串聯(lián)發(fā)酵的中間實(shí)驗(yàn)表明，由葡萄糖到2—KLG的總轉(zhuǎn)化率為84%。我國(guó)的尹光琳[7]等20于20世紀(jì)90年代初已經(jīng)開始進(jìn)行這方面的研究，他們誘變選育出歐文氏菌（Er-winiasp.）SCB247產(chǎn)2,5—DKG的能力提高了%，所得到棒狀桿菌誘變株SCB3058含有較高的產(chǎn)2—KLG能力（mL）。另外，張剛等[42]對(duì)SCB247和SCB3058串聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)2—KLG的工藝條件也做了研究，得出了類似的成果。這些研究為進(jìn)一步簡(jiǎn)化的生產(chǎn)工藝打下了基礎(chǔ)。新二步發(fā)酵法省去了D—葡萄糖加氫生成D—山梨醇的環(huán)節(jié)，大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工序，收率也很高，很有應(yīng)用前途。但這種辦法還存在許多問題，如中間產(chǎn)物2，5—DKG對(duì)熱不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率低，成本高。其在反映條件、菌體運(yùn)用等方面，與工業(yè)生產(chǎn)還含有一定的距離。一步發(fā)酵法不能以葡萄糖作為直接發(fā)酵原料是二步發(fā)酵法的最大缺點(diǎn)之一。以D-葡萄糖高壓加氫轉(zhuǎn)化生成D-山梨醇,不僅需要大量的能源和設(shè)備,操作上也存在很大的危險(xiǎn)性。考慮若能將歐文氏菌和棒狀桿菌有關(guān)的特性結(jié)合于一種微生物中,構(gòu)建VC“基因工程菌”,就可實(shí)現(xiàn)從D-葡萄糖到2-KLG的一步發(fā)酵。近年來,基因工程菌的研究已成為世界上熱點(diǎn)課題之一,美國(guó)、瑞士、法國(guó)、日本等許多國(guó)家都著力開展了此方面的研究。其過程如圖4所示：工程菌化學(xué)轉(zhuǎn)化D-葡萄糖2-KLGVc圖4一步發(fā)酵法工藝流程1985年,美國(guó)Genen2tech公司Anderson等人[43]成功地分離純化了棒桿菌(Corynebacteriumsp.)ATCC31090的2,5-DKG還原酶,并分析了該酶N-端的40個(gè)氨基酸序列,用原位雜交法從部分基因文庫(kù)中篩選到一種基因片段,再以已知片段為探針得到了完整基因,最后該基因被重組到了另一株發(fā)酵生產(chǎn)菌草生歐文氏菌(E.herbicolaATCC21998)中,得以有效體現(xiàn),從而實(shí)現(xiàn)了從D-葡萄糖到2-KLG的一步發(fā)酵。該法的合成效率很低,只有5%左右,重要是由于合成2,5-DKG的3種核心酶D-葡萄糖脫氫酶、D-葡萄糖酸脫氫酶、2-酮基-D-古龍酸脫氫酶(存在于周質(zhì)中)與2,5-DKG還原酶(存在于胞質(zhì))在細(xì)胞中所處位置的較大差別造成。后來Grindley等[44]通過改善,將棒桿菌的2,5-DKG還原酶的基因在E.citreus上體現(xiàn),將收率提高至49%。國(guó)內(nèi)部分VC生產(chǎn)廠家以及中科院上海生物工程研究中心也在進(jìn)行此項(xiàng)課題的研究,并獲得了很大的進(jìn)展。陳策實(shí)等[45]從棒狀桿菌SCB3058中初步純化得到的2個(gè)2,5-DKG還原酶,將2,5-DKG還原酶I基因片段在大腸桿菌中得到體現(xiàn)。全部這些都為最后構(gòu)建基因工程菌打下了基礎(chǔ)。由于至今尚未找到使葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)生VC的微生物菌種,現(xiàn)在發(fā)酵產(chǎn)生的2-KLG到VC的轉(zhuǎn)化仍是通過化學(xué)辦法。為了得到完整的使用細(xì)菌合成VC的生物轉(zhuǎn)化途徑,各國(guó)學(xué)者都在尋找能夠運(yùn)用2-KLG合成VC的菌種?，F(xiàn)在,Asakura等人[46]已從Zymomonasmobilis,Es-cherichiacoli以及Fusariumoxysporum中分離出了內(nèi)酯化酶,能夠用于2-KLG到VC的轉(zhuǎn)化,但是反映效率極低,尚有待進(jìn)一步研究。3.展望VC是我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)開發(fā)的首批西藥之一,也是我國(guó)最重要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。二步發(fā)酵法是我國(guó)VC生產(chǎn)的重要工藝辦法,然而該法不能直接以葡萄糖為發(fā)酵原料,且涉及二步發(fā)酵三種菌,工序繁瑣。采用基因工程等先進(jìn)技術(shù),選育直接以葡萄糖為發(fā)酵原料的優(yōu)良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件將是我國(guó)VC生產(chǎn)技術(shù)研究的重要方向。另外,現(xiàn)在世界上諸多國(guó)家正嘗試以真核生物為研究對(duì)象,運(yùn)用它們合成VC的代謝途徑開發(fā)更加環(huán)保的生物合成辦法[47～49]。從我國(guó)的二步發(fā)酵法推廣后逐步取代萊氏法這一過程能夠預(yù)測(cè),隨著生物技術(shù)的不停發(fā)展和更具優(yōu)勢(shì)的生物合成VC辦法的不停涌現(xiàn),生物法必將完全取代化學(xué)法在VC生產(chǎn)中的地位。為了保持我國(guó)在世界VC生產(chǎn)上的優(yōu)勢(shì)地位,必須加強(qiáng)VC生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究工作。參考文獻(xiàn)：[1]PrazeresDMF,CabralJMS1Enzymaticmembranebioreactorsandtheirapplications1EnzymeMicrob1Technol.,1994,16:738-750[2]鮑揚(yáng).維生素C與營(yíng)養(yǎng).腸與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng),1998,5(3):168-172[3]ConnerEM,GrishamMB1Inflammmionfreeradicals,andan-tioxidants1Nutrition,1996,12:174[4]JengKCG,YangCS,SiuWY,etal1SupplementationwithVitaminCandE-enhancescytokineproductionbyperipheralbloodmononuclearcellsinhealthyadults1Am1J.Clin1Nutr,1996,64:960[5]HalliwellB1Ascorbicacid;hype,hoax,orhealerAm.J..,1997,65:1891[6]李越中.維生素C二步發(fā)酵法第二步發(fā)酵混合菌的生理機(jī)制暨混合菌共固定化合成2-酮基-L古龍酸的研究.[博士后研究報(bào)告].沈陽:中科院沈陽應(yīng)用生態(tài)所[7]尹光琳,陶增鑫,于龍華,等．L－山梨糖發(fā)酵產(chǎn)生Vc前體2－酮基－L－古龍酸的研究．I．菌種的分離篩選和鑒定[J]．微生物學(xué)報(bào),1980,20(3):246－251．[8]UrbanceJW,BratinaBJ,StoddardSF,etal．TaxonomiccharacterizationofKetogulonigeniumvulgaregen．nov．sp．nov．a(chǎn)ndKetogulonigeniumrobustumsp．nov．,whichoxidizeL－sorboseto2－keto－Lgulonicacid[J]．IntJSystEvolMicrobiol,,51(3):1059－1070．[9]魏東芝，袁渭康，尹光琳，等;維生素C二步發(fā)酵法過程動(dòng)力學(xué)模型的研究[J].生物工程學(xué)報(bào)，1992,8(3):277-282.[10]馮樹，孫傳寶，張忠澤，等;維生素C二步發(fā)酵中巨大芽孢桿菌對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響[J].微生物學(xué)雜志，1998,18（1）：6-9[11]焦迎暉，張惟材，等;維生素C發(fā)酵中伴生菌對(duì)氧化葡糖桿菌的影響[J].微生物學(xué)通報(bào).,29(5):35-38[12]馬成新，焦鵬，胡江春，等;蛭弧苗J26轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵條件的研究[J].微生物學(xué)雜志，1998,18(2):1-6[13]許安，姚建銘，余增亮，等;離子注入改良維生素二步發(fā)酵混合菌的研究.2-酮基-L-古龍酸高產(chǎn)菌IPPM-1028的選育[J].工業(yè)微生物，1998,28(4):21-24[14]陳建華，馮瑞山，郗麗萍，等.2-酮基-L-古龍酸產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的屬間融合[J]中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，,33(1):9-11,24[15]周彬，張忠澤，等，VC二步發(fā)酵中的微生物生態(tài)調(diào)控[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào).,13(11):1452-1454[16]康學(xué)真，等，二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C種子培養(yǎng)的研究[C].第二屆全國(guó)青年微生物工作者學(xué)術(shù)會(huì)（濟(jì)南），.[17]蔣宇揚(yáng)，郭振勇，張成剛，等;維生素C發(fā)酵中2-酮基-L-古龍酸還原酶的研究[J].生物工程學(xué)報(bào).:(3):39-341[18]季光輝,燕方龍,苗春,等.新型絮凝劑用于維生素C發(fā)酵液預(yù)解決[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1997,14(2):88-90.[19]陳雷,張銘錫.維生素C生產(chǎn)提取除蛋白工藝的改善[J].黑龍江醫(yī)藥,,14(6):447-448.[20]陳永林,劉梅城,翟振山.板式超濾技術(shù)在VC生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),,31(9):136-137.[21]張林茂,高永濤,李晶.應(yīng)用超濾技術(shù)改善VC生產(chǎn)工藝[J].膜科學(xué)與技術(shù),,20(5):60-61.[22]何旭敏,何國(guó)梅,曾碧榕,等.膜分離技術(shù)的應(yīng)用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),,40(2):495-502.[23]劉坐鎮(zhèn),謝小華,徐惠珍,等.離子交換法提取α-酮基-L-古龍酸的研究[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1995,21(2):155-160.[24]錢衛(wèi)國(guó),沈金玉,高春滿,等.溶媒萃取α-氧代-L-古龍酸的初步工藝研究[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,1992,23(6):247-250,246.[25]李春艷,夏海平,藍(lán)偉光.維生素C生產(chǎn)工藝進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,,32(1):38-40.[26]AhmedbadTextileIndustryResearchAssoc.SynthesisofAscorbicAcidfrom2,3,4,6-di-σ-isopropylidene-2-keto-L-gulonicAcidMonohydrate[P].IN.149287.1981-10-17.[27]YODICER.ProductionofL-ascorbicfrom2-keto-L-gulon2icAcid[P].US.764246.09.[28]MURPHYA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