PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)課件

PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)疾病的診斷分子診斷影象學(xué)診斷細(xì)胞/組織診斷

臨

床

診

斷免疫診斷生化診斷PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)幾乎所有的疾病都是基因病科學(xué)研究已證明，基因可以揭示疾病的本質(zhì)，人類幾乎所有疾病都直接或間接與基因有關(guān)，在某種意義上都是基因病，PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)1985年美國人莫里斯（KaryMullis）發(fā)明了一種模擬DNA體內(nèi)復(fù)制過程，在體外復(fù)制特定DNA片段的方法，并將其命名為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）。PCR可以在短時(shí)間內(nèi)倍增極微量DNA（理論上說,僅有一個(gè)足夠了）至百萬或十億倍，通過PCR可以簡(jiǎn)便、快速地從微量生物材料中獲得大量特定的核酸，并具有很高的靈敏度和特異性，可用于微量核酸樣品的檢測(cè)。PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)PCR技術(shù)被科學(xué)界譽(yù)為生物技術(shù)領(lǐng)域最偉大的發(fā)明之一，美國人莫里斯在發(fā)明該技術(shù)不久就因此于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR及其相關(guān)技術(shù)于80年代末在國外開始應(yīng)用：歐共體（現(xiàn)歐盟）、日本、美國相繼把PCR這一基因診斷核心技術(shù)列入獻(xiàn)血員篩查，美國食物與藥品管理局已批準(zhǔn)了60多種基因診斷試劑用于臨床，美國國家疾病控制中心已把PCR技術(shù)列入疾病診斷的常規(guī)技術(shù)。PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，加入熒光標(biāo)記的基因探針，通過探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合釋放出熒光信號(hào)，再通過專門的儀器（熒光PCR儀）對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，經(jīng)過電腦分析以后，可以準(zhǔn)確計(jì)算出目的基因的初始數(shù)量，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)相比，熒光PCR檢測(cè)技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR檢測(cè)從定性到定量的飛躍，而且它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。因此，熒光PCR檢測(cè)技術(shù)自二十世紀(jì)九十年代中期出現(xiàn)以來，已成為最具代表性的PCR檢測(cè)技術(shù)，為PCR檢測(cè)技術(shù)臨床應(yīng)用打開了方便之門，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用。

熒光PCR檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介

PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)短柄圓環(huán)探針熒光PCR原理分子信標(biāo)是一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈，一般含有25～35個(gè)核苷酸。在結(jié)構(gòu)上，分子信標(biāo)大體上可以分為三部分：（1）、環(huán)狀區(qū)：一般由15～30個(gè)核苷酸組成，可以與靶分子特異結(jié)合；（2）、莖干區(qū)：一般由5～8個(gè)堿基對(duì)組成，在分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合過程中可發(fā)生可逆性解離。（3）、熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)：熒光基團(tuán)一般連接在5ˊ端；淬滅基團(tuán)一般連接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團(tuán)。根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成反比。所以只有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間達(dá)到一定的距離時(shí)才會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)熒光標(biāo)記熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài),而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM及其它熒光報(bào)告基團(tuán)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)探針熒光標(biāo)記及熒光基團(tuán)：如紅色熒光Cy3和綠色熒光Cy5標(biāo)記探針淬滅基團(tuán)常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)影響分子信標(biāo)的主要因素分子信標(biāo)中，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離是影響分子信標(biāo)的最主要因素。根據(jù)Foerster理論，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離直接影響熒光的強(qiáng)度。另外，溫度也是影響分子信標(biāo)的一個(gè)重要因素。在較低溫度下，分子信標(biāo)才可以保持發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在較高溫度下，分子信標(biāo)將無法保持其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，甚至使其伸展為隨機(jī)線狀，造成熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。有文獻(xiàn)表明，其熔鏈溫度取決于莖干區(qū)的長(zhǎng)度、G-C含量和緩沖液的離子強(qiáng)度PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。

PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判讀PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)熒光PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)管的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值是PCR3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，即：threshold=10×sdcycle6-15.熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)Ct值

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念—Ct值。C代表cycle，t代表threshold，Ct值的含義為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，Ct值越小，起始拷貝數(shù)越多，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，就可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出該樣品的起始拷貝數(shù)。PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR診斷試劑生產(chǎn)管理要點(diǎn)1、應(yīng)具有陽性血清（或陽性質(zhì)粒）處理、分裝的隔離實(shí)驗(yàn)室2、PCR試劑的生產(chǎn)區(qū)與檢定區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開3、專用原材料

PCR引物的設(shè)計(jì)要合理、合適，引物的合成要有固定的地方和設(shè)備，純度能到達(dá)一定標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)熒光定量PCR試劑的質(zhì)量檢查操作程序每次買來一批新試劑時(shí)，先觀察外包裝有無破損及有效期等，試劑運(yùn)輸過程中有無冷凍保存，如有異常，及時(shí)與廠家聯(lián)系。內(nèi)包裝：試劑是否漏液，真空包裝是否破損，試劑是否齊全以及是否有使用說明書等。試劑的靈敏度：取衛(wèi)生部臨檢中心購買的已知拷貝數(shù)的血清1份，并稀釋至10拷貝數(shù)，用新試劑檢測(cè)，計(jì)算出靈敏度。試劑的重復(fù)性：取從衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心購買的已知拷貝數(shù)的血清1份，用新試劑稀釋平行檢測(cè)10次，計(jì)算出SD，CV%。CV%應(yīng)在<30%。試劑的特異性：取臨床標(biāo)本10份（包括：低拷貝、高拷貝、陰性、高黃疸的標(biāo)本各2份），用新試劑檢測(cè)，用于考察試劑的特異性。PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)熒光定量PCR室內(nèi)質(zhì)控程序每天門診抽取病人血標(biāo)本時(shí)，須先仔細(xì)認(rèn)真核對(duì)化驗(yàn)單和病人姓名是否符合。編完化驗(yàn)單號(hào)后，在對(duì)血標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)時(shí)要仔細(xì)核對(duì)化驗(yàn)單的病人姓名與標(biāo)本管上的姓名，不得有誤。每次試驗(yàn)中，須同時(shí)測(cè)定1份陰性對(duì)照與一份質(zhì)控品。首次制作質(zhì)控圖時(shí)（新批號(hào)開始時(shí)），采用“即刻法”質(zhì)控方法，具體步驟如下：將連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值從小到大排列，即X1，X2，……XN計(jì)算均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)按下述公式計(jì)算SI上限和SI下限SI上限=(X最大值-X均值)/2SI下限=(X均值-X最小值)/2PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR定量為何要設(shè)內(nèi)參照？

影響PCR定量的主要原因有1、反應(yīng)效率的差異：可能為反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增儀的工作狀態(tài)所致。由于PCR產(chǎn)物增加按指數(shù)方式進(jìn)行，所以擴(kuò)增效率即使相差極小，也會(huì)極大改變產(chǎn)物的濃度。解決辦法就是設(shè)內(nèi)對(duì)照，使參照基因在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，起到校正作用，這樣，任何影響擴(kuò)增效率的因素同樣會(huì)影響兩種模板。2、終產(chǎn)物濃度的影響：終產(chǎn)物濃度達(dá)到一定水平后，不會(huì)再保持指數(shù)式增長(zhǎng)，而是進(jìn)入平臺(tái)期。解決辦法：系列稀釋待測(cè)模板，或在一定PCR反應(yīng)周期后間隔測(cè)定PCR終產(chǎn)物的濃度。PCR技術(shù)上崗培訓(xùn)PCR診斷試劑質(zhì)量控制要點(diǎn)1、酶活性測(cè)定2、引物序列的確定3、PCR加樣區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、檢測(cè)