熒光定量PCR實驗指南

PCR試驗指南第一局部一、 根本步驟：1、目的基因〔DNA和mRNA〕的查找和比對；2、引物、探針的設(shè)計；3、引物探針的合成；4、反響體系的配制；5、反響條件的設(shè)定；6、反響體系和條件的優(yōu)化；7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；8、標準品的制備；二、技術(shù)關(guān)鍵：1〔DNA和mRNA〕的查找和比對；從“:///網(wǎng)點的“:///網(wǎng)點的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為翻開某個序列后，直接點擊“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊“file”菜單中的“import”，翻開后點擊“save”，保存為“.seq”DNAstar軟件中的Editseq“file”菜單中的“openentrezsequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的DNAstar軟件中的Seqman軟件，點擊“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的全部文件，點擊“add”或“addall”，然后點擊“Done”“assemble”進展比較。橫線的參數(shù)設(shè)置的緣由，可能分為幾組(contig)，假設(shè)想全部放在一組中進展比較，就調(diào)整“project”菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimummathpercentage”默認設(shè)置為80，“contig”菜單下的“reassemblecontig”即可。選擇凹凸的原則是在保證所分析的序列在一個“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimummathpercentage”，要對“contig”的序列的排列進展修改，確保排列是每個序列的真實且排列同源性最好的排列。然后，點擊“save”的紅色是不行用的。2、引物和探針設(shè)計引物設(shè)計PCR中最重要的一步。抱負的引物對只加特異性的引物所具有的令人滿足的特點：2序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；2擴增片段長度依據(jù)技術(shù)的不同有所分別：sybrgreenI技術(shù)對片段長度沒有特別要求；Taqman50bp－150bp；244個以上連續(xù)配對；2避開引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡構(gòu)造；21824個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；2TM2℃；23’A；23’33個以上連續(xù)一樣的堿基。2為避開基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子。Taqman探針設(shè)計一般設(shè)計原則：2探針位置盡可能地靠近上游引物；225－35bp，Tm65－70℃，通常比引物TM5－10℃，GC40%－70%。25’G。2CG的含量。2blast中核實一次，假設(shè)覺察有非特異性互補區(qū)，建議重設(shè)計引物探針?！?///BLAST)“(/BLAST)TaqmanMGB探針設(shè)計介紹MGB探針的優(yōu)點：2MGB探針較短(14-20bp)，更簡潔找到全部排序序列的較短片段的保守區(qū)。2短片段探針(14-20bp)加上MGB后，Tm值將提高10℃，更簡潔Tm值的要求。2MGB探針的設(shè)計原則5G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。2用primerexpress軟件評價Tm值，Tm65-67℃。2盡量縮短TaqmanMGB13bp。2G4個或4G重復(fù)消滅。2原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。因此，在進展SNPTaqmanMGB檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。留意：為了滿4個條件，探針的突變位點可向3’端移動，但突變3’2個堿基的前方(即必需確保探針的后兩個堿基是確定的保守)，以進展SNP檢測。反過來，假設(shè)要進展同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點。假設(shè)探針即便是13bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應(yīng)產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設(shè)計簡并探針，也可到達即使是突變，仍可檢測到突變。實時多重PCR探針的選擇：多重實時PCRSYBRN染料，最終依據(jù)不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。多重實時PCRTaqman探MGBBeacon探針。在多重PCRPCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析:DNAstar軟件中的Primerselect軟件，翻開保守在同一文件中的多重PCR的引物計的多重探針后，在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上dimers。彈出的窗口中就告知此對引物有多少個dimerdG值進展評價(dG理論上是dG值越大越好)。3、影響PCRPCR的其他因素PCR的探針并進展設(shè)計對于實時熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計意味著確定的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的試驗結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素格外多，下面擇其重要進展介紹。引物退火溫度引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度〔Tm〕。這是當50％的引物和DNATm對于設(shè)定PCR退合理的退火溫度從55℃到70Tm5℃。設(shè)定TmTm——從序列一級構(gòu)造和相鄰oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時可以如下進展：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫TmTm5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。假設(shè)兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定Tm5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在依據(jù)較高Tm5個循環(huán)，然后再依據(jù)較低Tm設(shè)計得目的模板的局部拷貝。引物濃度0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增。為了確定引物濃度260nm〔OD260〕測量光密度值。然后使用光吸取值〔nmol/OBeers〔1〕計算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA使用計算的消光系數(shù)。這是由于引物較短，堿基組成差異很大。在oligo〔OD/μmol〕和消光系數(shù)的倒數(shù)〔μmol/OD〕。O.D.值表示量的多少，在一般狀況下，20個堿基長的引物，1個O.D.100ul水后引物濃度為50pmol/ul〔50μM〕OLIGO軟件，依據(jù)引物的的消濃度(μM)＝A260〔OD/ml〕×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)〔nmol/OD〕舉例：計算某寡核苷酸〔1ml水中〕，10μl稀釋100倍〔參加990μl〕水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消4.8nmol/OD，代入得：引物、探針的純度和穩(wěn)定性PCR應(yīng)用是足夠的。局部應(yīng)用DNA100％。這是個循環(huán)DNA3”到5”合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依靠于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-2010μMTE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫〔1530℃〕1周。干粉引物可以在-201年，在室溫〔1530℃〕最多可以2個月。針標記效率和純度有很大的區(qū)分。2uM〔10×〕，作為工作濃度分裝多支，避光保存。熱啟動熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最正確延長溫度在72PCRDNAPCR尤為有效。限制TaqDNAPCR反響PCR儀。這種方法簡潔廉價，但并不能DNAPCR儀到達TaqDNA聚合酶在內(nèi)的大局部手工Transitor?HotStartTaq酶對于自動熱啟動PCR來說高效可靠。Transitor?HotStartTaq是在常規(guī)Taq酶的根底上進展了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR隨著PCR擴增的進展，酶活會被逐步釋放，有效提高擴增效率及產(chǎn)物量。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶在變性步驟的9520分鐘才會被釋放到反響中，從而完全恢復(fù)聚合酶活性。鎂離子濃度PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μMdNTP的實時定量，使用3到5mM〔一般PCR是1.5mM〕PCR1mM3mM，以0.5mM遞增，進展鎂離子滴定。為削減Transitor?HotStartTaq酶。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶能夠在比一般的TaqDNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。模板質(zhì)量模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中覺察有多種污染物會抑制DNASDS，在0.01％時就會抑制擴增反響。分別基因組DNA較的DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)留意進展PCR反響的模板質(zhì)量，以增加PCR反響的成功率。模板濃度PCR擴增和熒光PCR104106個起始目的分子就足以觀測到好的熒光或在溴化乙錠染色膠上觀看到。所需的最正確模板量取決于基因組的大小〔下表〕。舉例說，100ng1μg的人類基因組DNA3×1043×105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNAPCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10－100ng的量就足夠PCR而言是格外簡潔，且能分析擴增效率。1.基因組大小和分子數(shù)目的比例基因組基因組DNASize(bp)*TargetAmountofE.E.coliSaccharomycescerevisiaeArabidopsisthalianaDrosophilamelanogasterHomosapiensXenopuslaevis1.0MusmusculusZeamayspUC18plasmidDNAMolecules/μgofGenomicDNADNA(μg)for-10^5Molecules4.7×1061.8×1080.0012.0×1074.5×1070.017.0×1071.3×1070.011.6×1086.6×1050.52.8×1093.2×1051.02.9×1093.1×1051.03.3×1092.7×1051.01.5×10106.0×1042.02.69×1033.4×10111×10-63.8 3.8 防止剩余〔Carry-over〕污染PCR易受污染的影響，由于它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產(chǎn)物用來進展的擴增反響時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘DNADNA也會是污染源〔非剩余污染〕?？梢栽赑CR過程中使用良好的試驗步驟削減剩余污染。使用帶eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在預(yù)備反響前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮员日諜z測污染。。DNA〔UD這種酶〔也稱為尿嘧啶-N-UNG〕DNA中的尿DNA區(qū)分開來。由于前面的擴增產(chǎn)物對UDG敏感，全部可以在PCR前對配制的反響用UDG處理以破壞剩余產(chǎn)物。其次局部1PCR試劑體系影響PCR的因素如此之多，您有時很難區(qū)分是什么導(dǎo)致您的試驗結(jié)果不佳。降低試驗的不穩(wěn)定因素是使用優(yōu)質(zhì)牢靠的產(chǎn)品。dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系，最大程度進展以下步驟的預(yù)備：設(shè)計引物和探針、合成引物和探針、正確就能得到好的試驗結(jié)果。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕同競爭對手的定量PCR體系相比供給了更優(yōu)異的結(jié)果。使用這種產(chǎn)品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時可以敏捷地選擇您所寵愛的擴增條件，檢測方法和設(shè)備。實時定量PCR是快速增長的PCR方法，它可以準確、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕是光PCR所必需的成分〔如緩沖液，dNTP，聚合酶。只需參加您的模板，擴增引物和熒光標記探針。您就可以得到實時qPCR所需的特異性和敏捷性。hotstartTaqkit(A2023A0106)，來配制不含有UNG/dUTPPCR體系。hotstartTaq酶，UNG酶和dNTPS,來配制含有UNG/dUTPPCR體系。量PCR試劑體系！高產(chǎn)量和特異性的擴增FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕PCR擴TaqDNA聚合酶具有熱啟得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG〔DNA糖基化酶〕DNA的擴增，從而降低了假陽性，使結(jié)果更牢靠。在產(chǎn)量和靈敏度方面，QuantitativePCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕的靈敏度極高〔閾循環(huán)〕。您可以更準確地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內(nèi)檢測線性劑量反響。高度敏捷性除了靈敏度和特異性外，UniversalPCRMasterMixKit在分析設(shè)置，檢測方法和設(shè)備上給您供給了較高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit，您可以：Mix體系。PCRPCR?？梢栽诙喾N設(shè)備上使用，如ABIPrism?7700,ABIGeneAmp?5700Bio-Rad的I-Cycler。TaqMan?探針和MolecularBeacon，您不必局限于特定的試劑盒。PCR體系，不管是含UNG/dUTP防污染系統(tǒng)還是不含該系統(tǒng)的。2A2023A0101試劑盒：〔探針體系〕FQ-PCRMasterMix-UNG混合物(2X)25ul〔終濃度為1×〕；上游引物〔終濃度為50~900nM〕〔可先設(shè)200nM〕，下游引物〔終濃度為50~900nM〕〔可先設(shè)200nM〕；探針〔終濃度200nM〕；5ul〔10~100ng〕；無菌去離子水補足，使總體積到達50ul。您可以選擇熒光染料SYBGREEN體系，具體請參照說明書。20-50ul間其他體積，留意保證終濃度一樣。A2023A0106:反響體系終濃度(自配熱啟動熒光系統(tǒng))：1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+ 、0.2mM的dNTPs、1×PCRbuffer〔A2023A0106〕；50－900nM的上游引物〔可先設(shè)200nM〕、50－900nM的下游引物〔可先設(shè)200nM200nM的探通常取2-5ul的模,無菌去離子水足，反響總體積通常為20－50ulUNG體系：1-2U的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+〔A2023A0105〕；0.2-1U的UNG酶(A2023A0107)〔可先設(shè)0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP〔要調(diào)整〕(A2023A0108)；50－900nM的上游引物〔200nM〕、50－900nM的下游引物〔200nM〕、200nM的探針、通2-5ul20－50ul。3、反響體系和條件的優(yōu)化:使用高產(chǎn)量，特異和敏捷的定量PCR試劑體系FQPCR MASTERMix-UDG〔hotstart〕，優(yōu)化參數(shù)最少。您只需PCR，您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結(jié)果。使用通用PCRMasterMix合更多的反響體系，如mRNA的一般RT-PCR檢測，適用于合成質(zhì)粒的PCRPCR，范圍更寬。hotstartTaq酶kit(A2023A0106)，該試劑盒中含有或不適宜產(chǎn)品的風(fēng)險。您需要依據(jù)以下原則進展優(yōu)化：1、您需要對酶量和鎂離子濃度進展優(yōu)化。酶的推舉反響濃度為1.25－1.5〔50u1-2UMg離子推舉濃度一般PCR1－3mM,熒光PCR終濃3－5.5mM，請在該范圍內(nèi)探討最正確條件。2dNTP已經(jīng)預(yù)混，能夠充分保證產(chǎn)品質(zhì)量和PCR的忠實性。dNTP0.2mM的濃度即可。3、另外，上游引物和下游引物濃度可先設(shè)為200nM。當結(jié)果不50nM－900nM之間進展探討。Taqman200nM，不須探討。選擇其他種類的探針需依據(jù)要求設(shè)置探針濃度。5、可以先用推舉的反響條件，假設(shè)結(jié)果不佳，可依據(jù)引物、探針設(shè)計的具體狀況適合的退火溫度，退火時間和循環(huán)數(shù)。6、DNA100ng以下，因不同種類的DNA定最正確的DNA2StepRT-PCR反響的其次步PCRRTDNA模板時的PCR10%。7、稀釋全部探針、引物或配制模板請使用無菌雙蒸水或Tris溶RNA反響應(yīng)承受無RNA降解酶的水和容器進展操作。如承受hotstartTaqA2023A0101一樣的熱啟動熒光體系〔UNG/dUTP防污染體系〕，您可以選擇A2023A0105，A2023A0107和A2023A0108進展。與A2023A0106不同的是除了以上的優(yōu)化步驟外，還增加了對UNG/dUTP系統(tǒng)進展探討。建議先使用A2023A0106優(yōu)化好產(chǎn)品體系后，再來優(yōu)化該防污染系統(tǒng)。0.2-1U的UNG酶(A2023A0107)〔0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP(A2023A0108)。反響條件如酶量、Mg離子等都已經(jīng)調(diào)好〔A2023A0106〕,您可以固定d(A,C,G)TPs0.2mM，并設(shè)定UNG濃度為0.5U(50ul)，dUTP濃度也設(shè)為0.2mM，初步來看反響結(jié)果。如dUTP濃度〔上調(diào)。直至得到滿足結(jié)果。并可進展防污染力量測試〔U的擴增片斷進展〕。3：影響PCRPCR的其他因素進展優(yōu)化?？傊?，優(yōu)化的指標越多，試驗的不確定性就越大。避開在操作中引入更QPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕使用留意事項。4、適用的熒光儀器、試驗設(shè)計、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；PCR儀：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000(AppliedBiosystems)；MX4000(Stratagene)；iCycler(Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler(MJResearch)；Lightcycler(Roche)；ROTORGENE(CORBERT)；杭州博日〔Linegene〕。不同的儀器使用方法有所區(qū)分，但都具備對Taqman探針和sybgreen染料法的檢測波長和檢測力量。QPCR MASTERMix-UDG〔hotstart〕和通用PCRMasterMix均適合在這些儀器上進展使用。4個標準2個復(fù)孔。個循環(huán)的熒光值作為閥值，也可以以陰性比照熒光值的最高點作為基線?？赡芫売山ㄗh解決方法定量DNA模板DMSO，SDSTaqDNA聚合酶。染了抑制劑，可以使用乙醇量或很 沉淀DNA少的擴PCR引物避開在引物3”端含有互補序列。避開可增產(chǎn)量設(shè)計較差 似的引物。比對，設(shè)計符合差 要求的探針PCR引物用一般電泳法，看引物的設(shè)計和合成質(zhì)合成較差 量，是否有目的條帶消滅。熒光探針無確保探針設(shè)計的有效性和fluorophore功能 和quencher的存在。用DNaseTaqMan否增加。必要的話設(shè)計和合成探針。10^42530低 個循環(huán)中獲得信號。鎂離子濃度從3mM到5mM間隔0.5mM進展一系列太低 應(yīng)，確定對于每個模板和引物對的最正確試劑盒不需優(yōu)化鎂離子濃度。介于0.1μM到0.5μM之低 間。為了準確確定引物濃度，在260nm測量光密度，然后使用光吸取值和消光系數(shù)計算濃度?！惨姽?〕選擇優(yōu)質(zhì)酶選擇hotstartTaq酶進展擴增，可提進展擴增 高靈敏度，增加產(chǎn)量，降低干擾因素退火溫度太使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設(shè)高 由于這些公式只是估算Tm些或低些。PCR承受無菌無酶無熱源的離心管進展試劑的分裝和使用。定量 引物、探針反響成分是否漏加；確定反響條件是否PCR性比照原來合成質(zhì)無擴增量已閱歷

題還是體系的問題；〔優(yōu)化好

確認體系：1、引物是否降解〔看擴增產(chǎn)來推斷引物和酶功能；2〔DNase處理TaqMan的體系〕 驗熒光是否增加〕。儀器是否正常工作定量 模板或PCR隔離污染來源，更換試劑。陰剩余污染性比照線

使用UNG/dUTP使用專用的精巧移液器。在無DNA的吸頭。體系有問題酶濃度不對，Mg離子濃度不對定量 引物二聚體檢查引物設(shè)計和合成環(huán)節(jié)，必要時更改PCR〔染多 引物料法出更換熱啟動熱啟動酶能增加反響的特異性，提高靈現(xiàn)非特酶 敏度異信號〔此時引〕定量 無cDNA合RT-PCR成無擴增cDNA合成降低保溫溫度產(chǎn)量 溫度太高相對熒反轉(zhuǎn)錄cDNA提高保溫溫度。重設(shè)計引物光信號產(chǎn)物被二級小于等構(gòu)造封閉于背景RNARNA或沒有害或降解模板對RNAse污維持無菌條件；參加RNase抑制劑照 染熒光探針無確保探針設(shè)計的有效性和fluorophore功能和quencher用DNase處理TaqMan否增加。必要的話設(shè)計和合成探針。靈敏度初始模板RNA10ng-1μg低RNA總RNA須在比預(yù)期更RNA被損害和降解必要的話更換RNA高的循RNAseRNase環(huán)中檢染出產(chǎn)物無效