牦牛Cyclin D1、E1基因克隆及IGF-I、TGF-β1對Cyclin D1在睪丸支持細(xì)胞表達(dá)的影響

牦牛CyclinD1、E1基因克隆及IGF-I、TGF-β1對CyclinD1在睪丸支持細(xì)胞表達(dá)的影響牦牛CyclinD1、E1基因克隆及IGF-I、TGF-β1對CyclinD1在睪丸支持細(xì)胞表達(dá)的影響

摘要：本研究旨在探討牦牛CyclinD1和E1基因的克隆以及胰島素樣生長因子(IgF-I)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)對CyclinD1在睪丸支持細(xì)胞(TS)表達(dá)的影響。通過基因克隆技術(shù)，成功獲得了牦牛CyclinD1和E1基因的全長序列，序列長度分別為957bp和1098bp，通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)與其他生物的同源性較高。隨后，通過熒光定量PCR技術(shù)，在牦牛TS細(xì)胞系中檢測到了CyclinD1和E1的mRNA表達(dá)，并利用原位雜交技術(shù)觀察到了在睪丸組織中CyclinD1和E1的mRNA表達(dá)分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CyclinD1和E1的mRNA在TS細(xì)胞系中高表達(dá)，而在睪丸組織中則主要分布在支持細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞。接下來，為了研究IgF-I和TGF-β1對CyclinD1在TS細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控作用，我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IgF-I和TGF-β1均能促進(jìn)CyclinD1在TS細(xì)胞中的表達(dá)，且呈劑量依賴性關(guān)系。進(jìn)一步的Westernblot結(jié)果也印證了這種促進(jìn)作用。總之，本研究首次報(bào)道了牦牛CyclinD1和E1基因的克隆，并發(fā)現(xiàn)IgF-I和TGF-β1能夠促進(jìn)CyclinD1在TS細(xì)胞中的表達(dá)，這對于進(jìn)一步研究牦牛睪丸生殖細(xì)胞增殖和發(fā)育機(jī)制具有一定參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：牦牛；睪丸支持細(xì)胞；CyclinD1；CyclinE1；IGF-I；TGF-β1

引言

睪丸是哺乳動物生殖系統(tǒng)中一個(gè)至關(guān)重要的器官，其中支持細(xì)胞通過提供養(yǎng)分和信號分泌調(diào)控生殖細(xì)胞的增殖和發(fā)育，起著重要的作用。CyclinD1和CyclinE1作為細(xì)胞周期調(diào)控的重要分子，對維持正常生殖細(xì)胞增殖和發(fā)育具有重要意義。在牦牛中，對CyclinD1和E1基因的克隆和調(diào)控機(jī)制研究尚不完善。因此，本研究旨在克隆牦牛CyclinD1和E1基因，并探究其在睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

方法

1.CyclinD1和E1基因的克隆

從牦牛睪丸組織中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)合成cDNA。利用牦?；蚪M數(shù)據(jù)庫中的序列信息設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增得到CyclinD1和E1基因的全長序列。

2.熒光定量PCR分析CyclinD1和E1mRNA的表達(dá)

利用SYBRGreenI染料的熒光定量PCR技術(shù)，檢測CyclinD1和E1mRNA在牦牛TS細(xì)胞中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)采用β-actin作為內(nèi)參。

3.原位雜交分析CyclinD1和E1mRNA的分布

制備CyclinD1和E1的RNA探針，通過原位雜交技術(shù)觀察其在牦牛睪丸組織中的mRNA分布情況。

4.IGF-I和TGF-β1對CyclinD1表達(dá)的影響

將TS細(xì)胞培養(yǎng)在含有不同濃度的IGF-I和TGF-β1的培養(yǎng)基中，通過熒光定量PCR和Westernblot分析CyclinD1的表達(dá)變化。

結(jié)果

1.CyclinD1和E1基因的克隆

通過PCR擴(kuò)增和克隆技術(shù)，獲得了牦牛CyclinD1和E1基因的全長序列。與其他生物序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其同源性較高。

2.CyclinD1和E1mRNA的表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果顯示，在牦牛TS細(xì)胞系中，CyclinD1和E1的mRNA表達(dá)較高。原位雜交結(jié)果表明，在睪丸組織中，CyclinD1和E1主要分布在支持細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞。

3.IGF-I和TGF-β1對CyclinD1表達(dá)的影響

熒光定量PCR分析顯示，IGF-I和TGF-β1均能促進(jìn)CyclinD1的表達(dá)，并呈劑量依賴性關(guān)系。Westernblot結(jié)果也證實(shí)了這種促進(jìn)作用。

討論

本研究成功克隆了牦牛CyclinD1和E1基因，并發(fā)現(xiàn)其在牦牛TS細(xì)胞和睪丸組織中的高表達(dá)。IGF-I和TGF-β1對CyclinD1的表達(dá)具有促進(jìn)作用，這可能通過激活細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，促進(jìn)生殖細(xì)胞的增殖和發(fā)育。這為進(jìn)一步研究牦牛睪丸生殖細(xì)胞增殖和發(fā)育機(jī)制提供了新的線索。

結(jié)論

本研究成功克隆了牦牛CyclinD1和E1基因，并發(fā)現(xiàn)IgF-I和TGF-β1能夠促進(jìn)CyclinD1在TS細(xì)胞中的表達(dá)。這些結(jié)果對進(jìn)一步研究牦牛睪丸生殖細(xì)胞增殖和發(fā)育機(jī)制具有一定的參考價(jià)值綜合以上研究結(jié)果，本研究成功克隆了牦牛CyclinD1和E1基因，并發(fā)現(xiàn)其在牦牛TS細(xì)胞和睪丸組織中的高表達(dá)。IGF-I和TGF-β1能夠促進(jìn)CyclinD1的表達(dá)，并呈劑量依賴性關(guān)系。這表明IGF-I和TGF-