香蕉幼苗防御酶活的研究

香蕉幼苗防御酶活的研究

香蕉萎縮，也稱為香蕉巴氏病和黃葉病，是一種由肝臟破壞引起的毀滅性疾病。其病原菌是尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusariumoxysporumf.sp.cubense,FOC),又稱香蕉枯萎病菌。木霉菌,作為重要的植物病害生防菌,已經(jīng)引起廣泛關(guān)注,在國內(nèi)外的研究中,利用綠色木霉防治植物病害,物別是土傳病害的報道很多,但是對于綠色木霉對植物抗病代謝的研究很少。誘導抗病性是指利用物理的、化學的以及生物的方法,預(yù)先處理植物,從而改變病害反應(yīng),使原來感病反應(yīng)產(chǎn)生系統(tǒng)或局部的抗性。植物組織內(nèi)的過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)等酶的活性大小,反映了植株抗病性的強弱。本研究通過測定施用綠色木霉H6以及病原菌菌液后,香蕉苗根部酶活性的變化趨勢,為進一步開發(fā)木霉生物殺菌劑奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1霉菌h菌株供試香蕉枯萎病病原菌(Foc4)以及生防木霉菌(H6)菌株為海南大學農(nóng)學院分離篩選保存菌株。供試香蕉苗為6葉的巴西蕉幼苗,大小基本一致,由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院組培中心提供。1.2測試方法1.2.1tt-lplau/ml將供試木霉菌H6、香蕉枯萎病病原菌,接種到PDA液體培養(yǎng)基中,于180r/min、28℃搖床中,培養(yǎng)4~5d,用無菌水稀釋到孢子濃度約為106CFU/mL,備用。分別于接種后的第1、3、5、7、9d,用消毒剪刀剪取新長出的香蕉葉片,液氮冷凍后于-80℃冰箱保存,用于酶粗液制備。1.2.3酶粗提液的制備將1g樣品,放入預(yù)冷的研缽中,加入1.5mL在4℃預(yù)冷的硼酸緩沖液及0.2g石英砂,冰浴中研磨成勻漿,4℃下靜置30min,再用10000r/min、4℃,離心30min,上清液即為酶粗提液。-20℃低溫保存。1.2.4丙氨酸為底物(1)過氧化物酶(POD)活性測定。以愈創(chuàng)木酚為底物,用陳捷等的方法測定。(2)PAL活性測定。以L-苯丙氨酸為底物,按許勇的方法有所改進。(3)CAT活性測定。以過氧化氫為底物,按陳捷等的方法測定。(4)SOD活性測定。以核黃素為底物,按王愛國等的方法測定。(5)PPO活性測定。以鄰苯二酚為底物,按陳捷等的方法測定。(6)酶粗提液及未知樣蛋白含量的測定。參照Broadford的方法,用考馬斯亮蘭G-250法進行。2接種木霉菌對第5d酶活的影響由圖1可知,先接木霉菌,1d后再接病原菌處理(H+F),酶活開始時變化不顯著,總體始終高于其他處理,其酶活在第5d達到最高峰,峰值為376.30U/(g·min),其后緩慢下降,在第9d時其酶活仍為對照組的3倍。接種病原菌處理(F),酶活力在第1~3d之間與對照處理(CK)酶活性無顯著差別,在第5d酶活性達到最高峰,峰值為209.67U/(g·min),其后又慢慢回落。接種木霉菌處理(H),酶活略低于處理(H+F),其酶活在第5d達到最大值,峰值為352.54U/(g·min)。對照組酶活變化不明顯,其變化范圍為74.67~105.05U/(g·min)。由圖2可知,先接木霉菌,1d后再接病原菌處理(H+F),酶活在第1d和第3d變化不顯著,稍大于只接病原菌處理(F),酶活在第5d達到最高峰,峰值為11.09U/(g·min),而后又急速下降,在第7d和第9d,酶活與只接病原菌處理(F)相差不大。接種病原菌處理(F),其酶活略高于對照,酶活在第5d時達到最大值,其峰值為5.53U/(g·min),酶活變化不顯著,其變化范圍為3.18~5.53U/(g·min)。接種木霉菌處理(H),在第3d酶活明顯高于其他各處理,其后在第5d酶活達到最大值,其峰值為10.46U/(g·min)。對照酶活變化不顯著,變化范圍為3.00~3.24U/(g·min)。2.3接種木霉菌對小鼠血清酶活的影響由圖3可知,先接木霉菌,1d后再接病原菌處理(H+F),從第3d酶活始終高于其他處理,在第5d達到酶活最高峰,峰值為96.65U/(g·min),而后緩慢下降,在第9d時,酶活仍為對照組的3倍。接種病原菌處理(F),酶活在第1d時明顯高于其他處理,分別在第1d和第5d達到最大值,其峰值分別為44.38、50.33U/(g·min)。接種木霉菌處理(H),酶活在第5d達到最大值,峰值為85.57U/(g·min),比處理(H+F)略低。對照組(CK),酶活變化并不明顯,變化范圍為26.84~28.31U/(g·min)。由圖4可知,接種木霉菌處理(H),第1d酶活低于其他處理,其后酶活明顯急速上升,在第5d達到最高峰,其峰值為210.27U/(g·min),而后急速下降,在第9d時,酶活降到與對照組值相當。接種病原菌處理(F),第1d酶活高于其他兩個處理,為130.14U/(g·min),隨后酶活變化不明顯,變化范圍為130.14~156.88U/(g·min)。接種木霉菌處理(H),第3d開始酶活始終高于其他處理,在第5d達到最高峰,峰值為250.48U/(g·min),而后酶活急速下降,第9d酶活下降到與對照組酶活值相當。對照組酶活變化不明顯,變化范圍為130.36~145.25U/(g·min)。由圖5可知,第1d時對照組酶活明顯高于各個處理組,酶活為100.32U/(g·min),為其他處理的2.7倍。接種木霉菌1d后接種病原菌處理(H+F),從第3d開始明顯高于其他處理組,在第5d達到最高峰,峰值為158.65U/(g·min),其后急速下降,在第7d降到最低,在第9d又有所回升。接種病原菌處理(F),酶活在第5d達到最高峰,峰值為187.33U/(g·min)。接種木霉菌處理(H),酶活在第5d達到最大值,峰值為221.32U/(g·min),變化趨勢同其他處理組大致相同。對照組酶活呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,變化范圍為35.67~100.32U/(g·min)。3接種木霉菌對香蕉幼苗葉片酶活性的影響POD是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶,它與植物代謝及抗逆性都有密切關(guān)系。植物在逆境下或衰老時,由于體內(nèi)活性氧代謝加強而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸,蛋白質(zhì)等生物大分子,并使細胞膜遭受損害,從而加速細胞的衰老和解體,過氧化氫酶可以清除H2O2,是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。本研究中,接種木霉菌1d后接種病原菌處理后香蕉苗中POD酶活性明顯增強,呈現(xiàn)由增到減的趨勢,且呈現(xiàn)急速上升,在第5d達到最高峰,而后緩慢下降。PAL是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶,與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān),對植物色素形成、植物細胞分化和木質(zhì)化過程、參與植物抗病作用與抗蟲害作用、參與植物抗逆境作用中有重要意義。本研究中,接種木霉菌1d后接種病原菌處理后的香蕉苗葉片中PAL顯著增加,呈現(xiàn)明顯的由增到減的變化趨勢,且其酶活高于其他處理。與POD酶活不同的是,其酶活呈現(xiàn)急速上升,在第5d達到最大值,而后酶活又迅速下降。CAT是植物體內(nèi)清除過氧化氫的主要酶類,植物代謝過程會產(chǎn)生活性氧自由基,再轉(zhuǎn)化成過氧化氫,而過氧化氫對植物細胞具有損傷作用。過氧化氫酶的主要功能即清除植物代謝過程產(chǎn)生的過氧化氫,從而對植物細胞具有保護作用,植物過氧化氫酶還與環(huán)境污染與脅迫、營養(yǎng)元素缺乏、病蟲害危害有關(guān)。本研究中,接種木霉菌1d后接種病原菌處理后的香蕉葉片中CAT酶活性開始時低于病原菌處理的,第3d后酶活性急速上升,第5d達到最高峰,其后下降趨勢緩慢。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì),能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),植物病原菌能夠誘導植株產(chǎn)生活性氧自由基,活性氧自由基過多累積會導致植株過敏性死亡。因此SOD是一種與植物的防御反應(yīng)密切相關(guān)的酶。本研究中,接種木霉菌1d后接種病原菌處理后的香蕉葉片中SOD酶活性顯著增加,并且呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在第5d達到最大值,在第1d和第9d時酶活與對照組相差不大。PPO是植物體內(nèi)普遍存在的一種非線粒體內(nèi)的末端氧化酶,它可以把酚類物質(zhì)如單酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、對苯二酚等氧化為相應(yīng)的醌類物質(zhì)。醌類物質(zhì)對病原微生物起著抑制作用或殺傷作用,具有一定的抗病能力。因此,在感病的植物體中,PPO活性都有不同程度的提高,以抵抗病原體進一步侵染健康的植物組織。本研究中,接種木霉菌1d后接種病原菌處理后PPO在第1d活性較低,而后出現(xiàn)上升趨勢,在第5d達到最大值,而后又出現(xiàn)急速下降,在第7d達到最低,然后又出現(xiàn)上升趨勢。試驗結(jié)果表明SOD、PAL、CAT、POD、PPO酶活性均明顯提高。證明先接種木霉菌后接種病原菌可以提升香蕉植株的抗病性,增強了植物