黃酮類化合物對小鼠血清黃嘌呤氧化酶活性的影響

黃酮類化合物對小鼠血清黃嘌呤氧化酶活性的影響

根據(jù)流行病學(xué)研究，頭痛的發(fā)病率正在增加，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也在增加。高尿酸血癥(hyperuricemia)是痛風(fēng)發(fā)展的一個關(guān)鍵性因素,而且與腎功能不全、心血管疾病、高血壓、高脂血癥、腫瘤、糖尿病以及代謝綜合癥的發(fā)生相關(guān)。血尿酸產(chǎn)生過多、腎臟尿酸排泄障礙或者這兩個因素的綜合作用導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生。黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)催化次黃嘌呤和黃嘌呤氧化為尿酸,因此,黃嘌呤氧化酶抑制劑因其能阻止尿酸的生物合成,被認(rèn)為是高尿酸血癥的潛在治療因素。黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜、水果、牧草和藥用植物中,是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物。雖然有文獻(xiàn)報道黃酮類化合物在體外能夠抑制黃嘌呤氧化酶的活性,但是黃酮類化合物在體內(nèi)是否能夠抑制黃嘌呤氧化酶活性,進(jìn)而降低血清尿酸水平仍未得到確切的實驗證實。本研究旨在確定黃酮類化合物染料木素(genistein)、芹菜素(apigenin)、槲皮素(quercetin)、蘆丁(rutin)和落新婦苷(astilbin)對體外黃嘌呤氧化酶活性、高尿酸血癥小鼠血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性以及血清尿酸水平的影響,同時測定小鼠給予黃酮類化合物后血清中的尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)和肌酐(creatinine)水平,來分析判斷對小鼠腎功能的影響。1材料表面1.1動物♂BALB/c小鼠(20±2)g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(軍)字第2002-005號。1.2黃系a黃嗪氧化酶氧嗪酸鉀potassumo體分析染料木素、芹菜素、槲皮素和蘆丁購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司(純度>98%),落新婦苷購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度>95%)。黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、別嘌醇(allopurinol)和氧嗪酸鉀(potassiumoxonate,PO)購自美國Sigma公司,其他試劑均為分析純。黃嘌呤氧化酶(XOD)測試盒、尿酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所,尿素試劑盒、肌酐試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。1.3高速分散均質(zhì)機(jī)Sartorius電子分析天平(德國賽多利斯天平公司),BiofugePrimoR多用途臺式高速離心機(jī)(德國Heraeus公司),FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠),RT-9600半自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。2方法2.1黃酮氧化活性分析2.2小鼠血清尿酸水平氧嗪酸鉀作為一種尿酸酶抑制劑用來誘導(dǎo)小鼠高尿酸血癥模型。根據(jù)文獻(xiàn)方法,最后1次給藥前1h,小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀(250mg·kg-1)以升高血清尿酸水平。給藥后1h,從小鼠尾靜脈采血,室溫下放置1h后3500r·min-1離心10min,移出血清置-20℃冰箱保存待測。用尿酸試劑盒(磷鎢酸法)測定小鼠血清尿酸水平。2.3計算給藥容積用蒸餾水溶解配制不同濃度的染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁和落新婦苷,根據(jù)每次給藥前的動物體重計算給藥容積。小鼠每天9點鐘灌胃給藥,連續(xù)7d。正常對照組和模型組給予蒸餾水灌胃,連續(xù)7d。最后1次給藥后1h尾靜脈取血,脫頸處死小鼠后取肝臟,制備樣品測定血清尿酸水平和血清及肝臟黃嘌呤氧化酶活性。2.4小鼠肝臟黃呤氧化酶活性檢測取出的小鼠肝臟迅速置于-70℃冰箱保存待測。肝臟樣本解凍后與生理鹽水1∶9混合,勻漿。勻漿液在4℃條件下8000r·min-1離心10min,小心撇去上層漂浮的油脂,上清液在4℃條件下繼續(xù)以15000r·min-1離心40min,取上清液測定小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性。血清樣本的制備同“2.2”方法。用黃嘌呤氧化酶試劑盒(分光光度法)測定血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性。血清黃嘌呤氧化酶活性的單位以U·L-1(μmol·min-1·L-1serum)表示,肝臟黃嘌呤氧化酶活性的單位以U·g-1(μmol·min-1·g-1Pro)表示。2.5腎功能測試血清樣本的制備同血清尿酸測定方法,用試劑盒和半自動生化分析儀測定尿素氮(BUN)和肌酐(creatinine)水平。2.6統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計量資料用表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。3結(jié)果3.1體外黃fige-nd-l-1別嘌醇體外對黃嘌呤氧化酶活性具有明顯抑制作用,IC50為14.5mg·L-1,而染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁和落新婦苷體外對黃嘌呤氧化酶抑制作用很微弱,甚至無抑制作用。3.2黃系對血清黃嘌呤氧化酶活性的影響染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁、落新婦苷及別嘌醇對高尿酸血癥小鼠血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響結(jié)果見Tab1。正常對照組和氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型組的血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性差異無顯著性。與正常對照組比較,別嘌醇(10mg·kg-1)明顯降低血清黃嘌呤氧化酶活性,同時明顯升高肝臟黃嘌呤氧化酶活性。染料木素(4.5mg·kg-1)明顯升高肝臟黃嘌呤氧化酶活性,但是對血清黃嘌呤氧化酶活性無影響。芹菜素(700mg·kg-1),槲皮素(100、200mg·kg-1),蘆丁(150、300mg·kg-1)和落新婦苷(1.0、9.0mg·kg-1)明顯降低肝臟黃嘌呤氧化酶活性,對血清黃嘌呤氧化酶活性無影響。而且,染料木素(9.0、18.0mg·kg-1)、芹菜素(175、350mg·kg-1)、槲皮素(400mg·kg-1)、蘆丁(75mg·kg-1)和落新婦苷(3.0mg·kg-1)對血清和肝臟黃嘌呤氧化酶活性均無影響。3.3不同給藥劑量對高尿酸特殊血染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁、落新婦苷及別嘌醇對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響結(jié)果見Tab2。正常對照組的血清尿酸水平為(46.49±4.33)mg·L-1,在氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型組,血清尿酸水平升高至(70.13±4.83)mg·L-1,表明氧嗪酸鉀成功誘導(dǎo)了高尿酸血癥模型。別嘌醇(10mg·kg-1)將高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平降低45.7%。槲皮素(200mg·kg}),蘆丁(75、300mg·kg-1)和落新婦苷(1.0、3.0mg·kg-1)能夠降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平,幅度為8.6%到16.5%。但是,血清尿酸水平依舊高于正常對照組。而且,染料木素(4.5、9.0、18.0mg·kg-1)、芹菜素(175、350、700mg·kg-1)、槲皮素(100、400mg·kg-1)、蘆丁(150mg·kg-1)和落新婦苷(9.0mg·kg-1)給藥的高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平與模型組相比較差異無顯著性。3.4影響高尿酸血癥小鼠腎功能4血清尿酸水平痛風(fēng)和高尿酸血癥是體內(nèi)尿酸水平異常的代謝性疾病,導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)和腎臟沉積,產(chǎn)生痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和腎石癥。黃嘌呤氧化酶主要存在于肝臟和腸道中,在嘌呤代謝途徑中氧化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸。預(yù)防和治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的目的是降低體內(nèi)血清尿酸濃度。黃嘌呤氧化酶抑制劑臨床上用來阻止尿酸合成的最后步驟,從而減少尿酸的產(chǎn)生。別嘌醇是目前臨床上最常使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑,但是它的應(yīng)用會產(chǎn)生一系列的毒副作用,如超敏反應(yīng)、腎功能損傷、6-巰基嘌呤毒性增強(qiáng)等。黃酮類化合物廣泛存在于植物中,具有黃嘌呤氧化酶抑制活性,此外,用來治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的并發(fā)癥如心血管疾病、糖尿病的食物和草藥中富含黃酮類化合物。本研究中,我們觀察到與過去的報道不一致,染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁和落新婦苷體外對黃嘌呤氧化酶無抑制活性,不同實驗結(jié)果的差別可能是由于不同的實驗條件引起的。但是,臨床上應(yīng)用的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇體外能夠明顯抑制黃嘌呤氧化酶活性(IC5014.50mg·L-1)。氧嗪酸鉀是一種選擇性的尿酸酶抑制劑,在嚙齒類動物中阻斷肝臟尿酸酶代謝,產(chǎn)生高尿酸血癥,氧嗪酸鉀處理的小鼠能夠作為高尿酸血癥模型來評價藥物對血清尿酸水平的影響。血清尿素氮和肌酐水平是評價腎功能的因子,腎功能損傷導(dǎo)致尿素氮和肌酐排泄障礙,血中尿素氮和肌酐水平升高。本研究的目的之一就是觀察這些黃酮類化合物對小鼠腎臟功能的影響,結(jié)果表明,染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁和落新婦苷對小鼠血清尿素氮和肌酐水平影響很小,意味著5種黃酮類化合物給藥后,對小鼠腎臟功能無明顯影響,繼而推斷對小鼠腎臟尿酸的排泄可能亦無影響,這需要在今后的尿酸排泄實驗中進(jìn)一步證實。以前大部分的研究集中在各種黃酮類化合物對黃嘌呤氧化酶體外抑制作用方面,然而,體外研究與體內(nèi)研究的結(jié)果不一定一致。本研究中,5種黃酮類化合物體外對黃嘌呤氧化酶活性無明顯影響,但能夠明顯影響高尿酸血癥小鼠體內(nèi)黃嘌呤氧化酶的活性。體外和體內(nèi)研究結(jié)果的不一致可能與黃酮類化合物在小鼠體內(nèi)的生物利用度不同以及廣泛的代謝有關(guān)。值得注意的是,從結(jié)果上看,當(dāng)小鼠血清中黃嘌呤氧化酶活性升高時,肝臟黃嘌呤氧化酶活性降低。當(dāng)小鼠血清黃嘌呤氧化酶活性降低時,肝臟黃嘌呤氧化酶活性升高。而且,小鼠血清黃嘌呤氧化酶活性與血清尿酸水平關(guān)系密切。例如,小鼠給予別嘌醇后,血清黃嘌呤氧化酶活性明顯降低,血清尿酸水平隨之明顯下降。相反,其它黃酮類化合物對血清黃嘌呤氧化酶活性無明顯影響,導(dǎo)致這些黃酮類化合物給藥后不能有效降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平。因此,小鼠血清尿酸水平與血清黃嘌呤氧化酶活性呈平行關(guān)系,而肝臟黃嘌呤氧化酶活性對血清尿酸水平影響較小。本研究測試的5種黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、進(jìn)入小鼠體內(nèi)的吸收、代謝的不同可能導(dǎo)致不同代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,繼而表現(xiàn)出對黃嘌呤氧化酶不同的抑制作用?？傊?盡管染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁和落新婦苷給藥后不能有效降低小鼠血清尿酸水平,不能夠替代別嘌醇從降尿酸的角度來治療痛風(fēng)。但是這些黃酮類化合物具有的抗氧化性和抗炎作用也許為今后有效治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎藥物的開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。采用改良的紫外分光光度法測定染料木素、芹菜素、槲皮素、蘆丁和落新婦苷體外對黃嘌呤氧化酶的抑制作用。全部試樣用蒸餾水溶解,精密量取0.1ml試樣(10、25、50、100、250、500mg·L-1)至5ml塑料離心管中,加入2.9ml200mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH7.5),然后加入0.1ml新鮮配制的黃嘌呤氧化酶溶液(0.4U·ml-1,pH7.5),分析混合物在37℃條件下孵化10min。加入2.0ml新鮮配制的黃嘌呤底物(1.5mmol·L-1)啟動酶促反應(yīng),混合物在37℃條件下孵化30min,加入1.0ml鹽酸(1mol·L-1)終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物的吸光度值設(shè)為292nm。黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇(2.5、5.0、10、25、50、100mg·L-1)作為陽性對照。黃嘌呤氧化酶的活性采用黃嘌呤氧化酶的抑制百分率表達(dá),即inhibition/%=(1-β/α)×100%。α是沒有黃酮類