m4受體激動劑毛果蕓香堿對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

m4受體激動劑毛果蕓香堿對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

心肌缺血時，交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，增加心肌收縮力，減少氧氣消耗，加劇血氧供氧失衡。此時,若激動心肌M3受體,則可誘發(fā)一種延遲整流鉀電流(IKM3),使心率減慢、心肌收縮力減弱,從而對抗交感神經(jīng)過度興奮,減少心肌耗氧量,對缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用,故心肌M3受體成為抗心肌缺血性損傷藥物作用的新靶點(diǎn)。M3受體激動劑毛果蕓香堿(pilocarpine)能激活心肌M3受體、誘發(fā)IKM3,呈劑量依賴性調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞電生理特性,即降低竇性節(jié)律、縮短動作電位時程、膜電位超極化,進(jìn)而產(chǎn)生負(fù)性肌力和負(fù)性頻率的調(diào)節(jié)作用。因而推測,毛果蕓香堿可通過激動心肌M3受體對缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察M3受體激動劑毛果蕓香堿對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。1材料和方法1.1動物健康Wistar大鼠,280～320g,雌雄各半(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)。1.2抗氧化酶sod毛果蕓香堿(Sigma公司);4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine-methiodide(4-DAMP,加拿大蒙特利爾心臟研究所惠贈);丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所);紅四氮唑(redtetrazoline,中國華東師范大學(xué)化工廠);肝素鈉(heparin,中國上海第一生化藥業(yè)公司制品廠);戊巴比妥鈉(pentobarbital,中國上海試劑二廠)。1.3動玻璃勻漿機(jī)和溫度高速離心浴鍋Langendorff灌流裝置(按參考文獻(xiàn)搭建);DY89-1型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科技股份有限公司);CS-15R低溫高速離心機(jī)(Beckman公司);數(shù)控恒溫浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司);2100型&UV-2100型分光光度計[尤尼柯(上海)儀器有限公司]。1.4k-h液灌流組kh2大鼠以1%戊巴比妥鈉(40mg·kg-1)腹腔麻醉,經(jīng)舌下靜脈肝素化(500u·kg-1),10min后固定在手術(shù)臺上,打開胸腔后小心快速分離心臟,在主動脈距其起始部4～5mm處迅速將主動脈和其他血管一并剪斷,立即置于盛有4℃冷K-H液的培養(yǎng)皿中,洗凈殘血,在液面下找出主動脈斷端,迅速套入主動脈套管并固定。立即灌注通有95%O2和5%CO2混合氣體的K-H液(mmol·L-1:NaCl118.5,KCl4.8,CaCl22.5,NaHCO325.0,KH2PO41.2,MgSO4·7H2O1.2,Glucose11.1,灌流液的pH為7.4)。剪去心臟周圍附著的組織,并于肺動脈起始部與右室圓錐部之間剪一小口,使冠脈回流液流出,維持灌注液高度在75cm左右,灌流液溫度保持在37℃。穩(wěn)定灌流10min后,將全部心臟隨機(jī)分為4組,每組8只,即①空白對照組(Normal組):正常K-H液連續(xù)灌流65min;②單純?nèi)毖俟嘟M(IRI組):正常K-H液灌流10min,然后全心停灌25min,再灌30min;③毛果蕓香堿組(pilocarpine組):用含有5μmol·L-1毛果蕓香堿的K-H液灌流,余同②;④4-DAMP+毛果蕓香堿組(4-DAMP+pilocarpine組):用含有3nmol·L-14-DAMP和5μmol·L-1毛果蕓香堿的K-H液灌流,余同②。2觀察指標(biāo)2.1主動脈泄漏液體積測量分別將停灌前、復(fù)灌后1,5,10,15,20,25,30min等8個時間點(diǎn)的冠脈流出液用量筒收集并測量其體積,以mL·min-1表示。2.2心肌酶活性測定灌流結(jié)束后,立即剪下左室,用冰生理鹽水制10%心肌勻漿,用于測定心肌MDA含量和SOD活性。MDA采用硫代巴比妥酸法測定,SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定。2.3心肌細(xì)胞的染色灌流結(jié)束后,立即剪下左室,每隔2mm將心肌橫切成片,用濾紙吸去表面水份,放入1%紅四氮唑磷酸緩沖液(pH7.4)37℃染色15min。梗死心肌細(xì)胞中的脫氫酶因細(xì)胞膜損傷而完全釋放丟失,因而梗死心肌不被染色;正常心肌細(xì)胞含有脫氫酶,可被染為紅色。剪下梗死心肌稱取質(zhì)量,以梗死心肌占左室質(zhì)量的百分比表示梗死范圍。2.4統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示,組間采用t檢驗(yàn)比較。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。3結(jié)果3.1專前控制和4-damp處理單純?nèi)毖俟嘟M的冠脈流量隨復(fù)灌時間的延長而顯著下降,與空白對照組相比均有顯著性差異(P<0.01)。毛果蕓香堿可使缺血再灌注后的冠脈流量增加,其中5和10min的冠脈流量分別由單純?nèi)毖俟嘧⒔M的(4.1±1.0)mL·min-1和(4.1±0.8)mL·min-增加到(5.7±1.2)mL·min-1(P<0.01)和(5.4±1.2)mL·min-1(P<0.05);而4-DAMP則使缺血再灌注后5和10min的冠脈流量減少,分別減至(4.4±0.9)mL·min-1(P<0.05)和(4.4±0.7)mL·min-1(P<0.05)。說明毛果蕓香堿可改善心肌缺血再灌注后的冠脈流量,而4-DAMP可阻斷其作用。見表1。3.2毛果蕓香堿對心肌組織中mda的降血藥單純?nèi)毖俟嘟M的MDA含量由空白對照組的(10.1±3.9)μmol·g-1升高至(14.3±4.1)μmol·g-1(P<0.05);而SOD活性則由空白對照組的(191±55)U·mg-1下降至(128±36)U·mg-1(P<0.01),表明心肌缺血再灌注可產(chǎn)生大量氧自由基而引起心肌損傷。然而,毛果蕓香堿可使心肌MDA含量降低,由單純?nèi)毖俟嘧⒔M的(14.3±4.1)μmol·g-1降至(10.1±2.5)μmol·g-1(P<0.05);同時,提高心肌SOD活性,使其由單純?nèi)毖俟嘧⒔M的(128±36)U·mg-1升高到(183±65)U·mg-1(P<0.05),說明毛果蕓香堿可通過提高心肌SOD活性、降低其MDA含量,對氧自由基引起的心肌損傷起到保護(hù)作用。見表2。3.3毛果蕓香堿可減輕心肌缺血再灌注所引起的心肌梗死毛果蕓香堿降低心肌梗死面積,使其由單純?nèi)毖俟嘧⒔M的(37.8±13.6)%降至(24.9±6.3)%(P<0.05),說明毛果蕓香堿可減輕心肌缺血再灌注所引起的心肌梗死;而4-DAMP可阻斷其作用,使心肌梗死范圍由毛果蕓香堿組的(24.9±6.3)%擴(kuò)大到(35.8±9.6)%(P<0.05)。見表3。4相對保護(hù)作用本實(shí)驗(yàn)探討了M3受體激動劑毛果蕓香堿對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明,毛果蕓香堿通過激動心肌M3受體可改善心肌缺血再灌注后的冠脈流量、降低心肌MDA含量并提高心肌SOD活性、縮小心肌梗死面積,進(jìn)而減輕缺血再灌注時的心肌損傷,對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。心肌缺血再灌注后,冠脈收縮導(dǎo)致低灌、冠脈流量減少等現(xiàn)象。因此,心肌缺血再灌后冠脈流量的變化可間接反映心肌損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單純?nèi)毖俟嘧⒔M的冠脈流量隨復(fù)灌時間延長而顯著下降。應(yīng)用毛果蕓香堿后,則冠脈流量明顯增加;預(yù)先給予4-DAMP則毛果蕓香堿的作用受抑。提示毛果蕓香堿通過激動心肌M3受體來改善冠脈流量、糾正心肌缺血狀態(tài)。當(dāng)組織細(xì)胞缺血缺氧時,氧自由基清除系統(tǒng)功能降低或喪失,而氧自由基生成系統(tǒng)活性增強(qiáng),氧自由基大量產(chǎn)生與急劇“堆積”,引起心肌組織嚴(yán)重?fù)p傷;該損傷程度可通過心肌MDA含量變化和SOD活性變化間接評定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,心肌缺血25min再灌注30min后,心肌MDA含量升高而SOD活性降低。應(yīng)用毛果蕓香堿后,心肌MDA含量降低、SOD活性提高;預(yù)先給予4-DAMP則毛果蕓香堿的作用受抑。提示毛果蕓香堿通過激動心肌M3受體來抑制脂質(zhì)過氧化過程、提高內(nèi)源性抗氧化酶活性,減輕氧自由基對心肌的損傷。這與激動心肌M3受體對心肌缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有保護(hù)作用的研究相一致。心肌缺血缺氧過程中,心肌細(xì)胞既出現(xiàn)壞死,又發(fā)生凋亡。心肌細(xì)胞凋亡決定心肌梗死面積的大小,而后者又間接反映心肌損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,毛果蕓香堿可縮小心肌缺血再灌注時心肌梗死的面積;該作用可被4-DAMP阻斷。說明毛果蕓香堿通過激動心肌M3受體來減輕心肌缺血再灌注損傷。這與激動心肌M3受體對心肌缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用的研究是一致的。心肌缺血,細(xì)胞外Ca2+大量內(nèi)流導(dǎo)致心肌細(xì)胞Ca2+超載,引起心肌細(xì)胞能量耗竭、細(xì)胞膜受損等反應(yīng),轉(zhuǎn)而加重心肌缺血再灌注損傷。激動心肌M3受體可減輕氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Ca2+超載;另外,本課題組已證實(shí),毛果蕓香堿通過激動心肌細(xì)胞M3受體可抑制氯化鉀