麻黃湯致足跖胰腺癌分泌活動的超微結(jié)構(gòu)觀察

麻黃湯致足跖胰腺癌分泌活動的超微結(jié)構(gòu)觀察

呼吸道感染是一種常見的臨床疾病。由于污染和抗生素濫用，自我意識的自然體驗從7天延長到1個月以上。感冒為萬病之首,感冒在西醫(yī)上無特殊的治療手段,而祖國醫(yī)學(xué)對感冒等病邪在表的太陽病的治療有其獨特的診療手段,通過綜合調(diào)整人體功能,改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境,提高免疫調(diào)節(jié)機(jī)能和機(jī)體抵御疾病的能力,阻斷病情的進(jìn)一步發(fā)展,對減少并發(fā)病、后遺癥具有積極的作用,二千年的臨床實踐證明,以發(fā)汗作為治療手段的代表方——麻黃湯在治療上感,抗病毒方面明顯優(yōu)于抗生素的治療。為了祖國醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)揚(yáng)光大,運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)研究方法及手段分析復(fù)方麻黃湯的有效成分,藥理作用及毒副作用,開發(fā)中藥新藥,改變劑型,適應(yīng)國際市場,已勢在必行。本研究通過觀察汗腺上皮細(xì)胞分泌活動的超微結(jié)構(gòu)變化,從形態(tài)學(xué)上揭示麻黃湯發(fā)汗作用的機(jī)理。1材料和方法1.1實驗動物及儀器Sprague-Dawley白化大鼠(簡稱SD大鼠),川實動管制第8號,雄性,體重250～300g,由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。1.2學(xué)生理公司活動劑2.6g/ml麻黃湯(每ml含生藥量),由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室提供,10%毛果蕓香堿(又名匹魯卡品),25%烏拉坦由成都中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室提供,3%戊二醛(磷酸鹽緩沖液配制),PH6.8,海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站,1%鋨酸(英國產(chǎn)),10%甲苯胺蘭(醋酸配制),丙酮(上?；瘜W(xué)試劑上廠),十二烯基丁二酸酐,甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐(日本進(jìn)口上海分裝,批號870921),環(huán)氧樹脂618(富順晨光化工廠生產(chǎn)),2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚(上海試劑三廠),檸檬酸鉛,硝酸鉛,醋酸雙氧鈾(重慶北碚化學(xué)試劑廠)。1.3半導(dǎo)體溫度劑MS302多媒體化生物記錄分析系統(tǒng),由廣東藥學(xué)院研制提供,7151型半導(dǎo)體溫度劑,上海醫(yī)用儀表廠生產(chǎn),LKB-7800型制刀機(jī),LKB-Ⅴ型切片機(jī),JEOL-100SX型透射電子顯微鏡,日本電子公司株式會社生產(chǎn)。1.4麻黃湯給藥劑量250～300g雄性SD大鼠77只隨機(jī)分成5組。生理鹽水對照組15只,發(fā)汗工具藥毛果蕓香堿組11只,麻黃湯高、中、低劑量組分別是17只。對照組灌胃生理鹽水。麻黃湯:高劑量組為人服劑量的30倍(人服劑量26g/dtid),中劑量組為人服劑量的15倍,低劑量組為人組均服劑量的7.5倍,以上4組以1ml/100g灌胃給藥。毛果蕓香堿組:皮下注射給藥35mg/kg。1.5大鼠雙術(shù)后第3足皮細(xì)胞的紫外電泳觀察大鼠灌胃生理鹽水、麻黃湯后30分鐘,1小時,2小時,皮下注射毛果蕓香堿后30分鐘,1小時觀察大鼠皮膚汗點的情況及皮膚電生理的變化,并迅速取每只大鼠雙后肢第3足跖底部的肉墊皮膚及皮下組織,將所取的組織固定于3%戊二醛溶液中2小時,pH6.8,溫度4℃,1%鋨酸后固定1小時,丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂包埋,半薄切片用10%甲苯胺蘭染色,普通光學(xué)顯微鏡觀察,放大倍數(shù)400倍,觀察汗腺上皮細(xì)胞的空泡數(shù),超薄切片采用檸檬酸鉛,醋酸鈾雙重染色,JEOL-100sx透射電子顯微鏡觀察,加速電壓80kv。2結(jié)果2.1各組大鼠足跖腺探索大鼠足底汗腺系小汗腺屬于管狀腺,它由導(dǎo)管(真皮內(nèi)導(dǎo)管和表皮內(nèi)導(dǎo)管)和分泌部組成,小汗腺分泌部僅一層分泌細(xì)胞,分泌方式為局部分泌。分泌部位于真皮和皮下組織交界處或在真皮下1/3處,在分泌管腔周圍有肌上皮細(xì)胞,其功能是幫助汗腺細(xì)胞汗液的泌出,分泌管腔內(nèi)分泌細(xì)胞有兩型:(圖1)亮細(xì)胞和暗細(xì)胞,它們的數(shù)目大致相等,但亮細(xì)胞比暗細(xì)胞略大,基底部寬而近腔面窄,含有豐富的糖原顆粒。生理鹽水對照組,汗腺分泌部管腔切面數(shù)量較少,毛果蕓香堿組大鼠足跖汗腺分泌部管腔切面數(shù)量最多,且分泌細(xì)胞的核下空泡數(shù)也最多,此空泡經(jīng)PAS、阿爾新蘭和蘇丹Ⅳ染色,排除糖原、酸性粘多糖、脂肪類物質(zhì)(圖2)。麻黃湯組則隨濃度的升高,其分泌部管腔橫切面數(shù)目及分泌細(xì)胞的空化率也隨之增加,并隨藥物作用的時間不同,分泌細(xì)胞空泡化的程度也不一樣(圖3)。結(jié)果見表1、2。實驗結(jié)果表明:麻黃湯中、低劑量組于半小時對汗腺分泌細(xì)胞的影響與生理鹽水組比較差異無顯著性(P>0.05),但高劑量組差異有顯著性(P<0.05)。麻黃湯高、中、低劑量組灌胃后1小時和2小時對汗腺分泌細(xì)胞的影響與生理鹽水組比較差異均有極顯著性(P<0.01)。麻黃湯作用高峰時間在灌胃后2小時左右,此時與毛果蕓香堿組的高峰作用時間1小時對汗腺分泌的影響比較差異也有顯著性(P<0.01)。由此可見麻黃湯能影響大鼠足跖汗腺分泌細(xì)胞的形態(tài)變化,但作用強(qiáng)度不及毛果蕓香堿。2.2可汗上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化2.2.1各組胞外周血因子的微織構(gòu)變化大鼠足跖汗腺在電鏡下觀察可分為電子密度低的亮細(xì)胞和電子密度高的暗細(xì)胞。亮細(xì)胞體積大,基底部較寬,近腔面較窄,細(xì)胞核圓形靠近分泌管腔側(cè),核內(nèi)異染色質(zhì)附著于核周,個別細(xì)胞可見核仁,胞質(zhì)內(nèi)有豐富的糖原顆粒和相當(dāng)量的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),線粒體圓形或橢圓形,數(shù)量較少位于核下近基底部,嵴呈板層狀。暗細(xì)胞體積小,近腔面寬而基底部窄,細(xì)胞核圓形,胞質(zhì)內(nèi)核蛋白體豐富,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)校多,線粒體圓形或橢圓形,大小不一,數(shù)量多,嵴板層狀,可見許多電子致密的分泌顆粒,管腔面有大量的微絨毛,分泌細(xì)胞間有很多絨毛狀皺褶互相嵌合,個別細(xì)胞內(nèi)可見毛細(xì)分泌小管,該處質(zhì)膜形成許多微絨毛并與腺腔相通。分泌管基底膜下可見核小呈梭形的肌上皮細(xì)胞,胞漿內(nèi)有長而富有收縮性的原纖維,原纖維螺旋式走行,其長軸與分泌管方向形成斜形,肌上皮細(xì)胞外周還有一層含有膠原纖維的透明基底膜帶。毛果蕓香堿組:用藥半小時,汗腺分泌細(xì)胞的明、暗細(xì)胞可辯,暗細(xì)胞線粒體多,個別線粒體有空化現(xiàn)象,在核下近基底膜可見電子致密的分泌顆粒,有文獻(xiàn)報道這些分泌顆粒屬唾液粘蛋,胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,充滿了密度高均質(zhì)狀的分泌物,核蛋白顆粒略有減少。密度低的亮細(xì)胞,細(xì)胞器較少,線粒體較小,數(shù)量也較少,細(xì)胞內(nèi)糖原顆粒減少,相鄰兩分泌細(xì)胞之間的微絨毛指狀相嵌減少,細(xì)胞間隙增大,內(nèi)有密度高的均質(zhì)狀分泌物,與細(xì)胞內(nèi)的一樣。1小時后,汗腺分泌細(xì)胞核由圓形變成不規(guī)則形,核內(nèi)異染色質(zhì)致密塊狀分布在核下周膜,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒,且擴(kuò)張加劇,池內(nèi)充滿了密度高均勻狀的分泌物,核蛋白顆粒減少,線粒體腫脹,脫顆粒斷嵴,甚至空泡化,胞漿內(nèi)糖原顆粒減少至消失(圖4),亮細(xì)胞內(nèi)空泡化程度更重,個別細(xì)胞除殘存少許的膜性結(jié)構(gòu)外,整個細(xì)胞都被大小不一的空泡充滿,相鄰兩細(xì)胞間隙進(jìn)一步加寬,大量分泌物充填其內(nèi),細(xì)胞間毛細(xì)分泌小管增大,腔面及細(xì)胞間微絨毛數(shù)量減少。汗腺分泌管腔的肌上皮細(xì)胞呈收縮狀。麻黃湯低劑量組:用藥半小時汗腺分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與生理鹽水對照組無明顯差異,1小時分泌細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)腫脹,分泌細(xì)胞的空泡變大,數(shù)目增多,細(xì)胞間毛細(xì)分泌小管輕度擴(kuò)張,個別分泌細(xì)胞內(nèi)存在微細(xì)分泌小管,小管的微絨毛呈短小棒狀,分泌細(xì)胞漿內(nèi)有少許密度高的分泌顆粒,2小時的分泌細(xì)胞空泡增大、數(shù)目增多更為嚴(yán)重。麻黃湯中劑量組:用藥半小時汗腺分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變較同時間低劑量組明顯,但與生理鹽水組比較無顯著性差異(P>0.05),用藥1小時,汗腺分泌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的電子密度高的分泌顆粒,線粒體斷嵴脫顆?，F(xiàn)象更加嚴(yán)重,核蛋白顆粒及糖原顆粒進(jìn)一步減少,胞漿內(nèi)空泡增大,兩分泌細(xì)胞間相嵌連結(jié)顯著減少,腔面微絨毛數(shù)目減少。2小時分泌細(xì)胞內(nèi)的線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒程度加劇,糖原顆粒減少程度較用藥1小時和同時間低劑量組更甚,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)及細(xì)胞間隙未見電子密度高呈均質(zhì)狀的分泌物。麻黃湯高劑量組:半小時的超微結(jié)構(gòu)變化類似中濃度組的1～2小時的情況,高劑量組在用藥1小時后分泌細(xì)胞之間的間隙顯著增寬,兩細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)消失,間隙內(nèi)有少量電子密度高的分泌物,分泌細(xì)胞的線粒體數(shù)量較多,大小不一,嵴脫顆粒及空化現(xiàn)象不及中濃度組2小時的情況。本組用藥2小時,分泌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)相互融合的巨大空泡(圖5),此時線粒體斷嵴脫顆粒及空泡化現(xiàn)象甚為嚴(yán)重,糖原顆粒消失,細(xì)胞間指狀相嵌連結(jié)消失,有少許電子密度高的分泌物充填其間。2.2.2電子密度與細(xì)胞數(shù)量實驗結(jié)果表明:在麻黃湯的各實驗組中,高劑量組發(fā)汗作用最強(qiáng),超微結(jié)構(gòu)改變最明顯,尤其是灌胃后2小時,汗腺分泌細(xì)胞內(nèi)線粒體空化嚴(yán)重,細(xì)胞內(nèi)巨大空泡形成,糖原顆粒消失,細(xì)胞間隙增寬,可見少許電子密度高的分泌物。而毛果蕓香堿組的超微結(jié)構(gòu)改變發(fā)生較早,與麻黃湯高劑量組比較其致汗腺分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變有些不同,它使細(xì)胞出現(xiàn)巨大空泡,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,池內(nèi)及細(xì)胞間隙都出現(xiàn)密度高不定型的分泌物,但糖原顆粒減少、線粒體斷嵴脫顆粒及空泡化程度不及麻黃湯高劑量組在用藥2小時的情況。3討論3.1解表流轉(zhuǎn)的實驗結(jié)果本研究的實驗動物全部選用雄性大鼠,排除了雌激素、孕激素對機(jī)體基礎(chǔ)代謝的影響,灌服麻黃湯后全部大鼠均不制動,減少神經(jīng)因素對汗腺的影響—當(dāng)機(jī)體精神處于緊張狀態(tài),隨之而出現(xiàn)的無意識的肌緊張以及刺激代謝的內(nèi)分泌激素釋放增多等原因,產(chǎn)熱量顯著增加。采用形態(tài)學(xué)的方法在細(xì)胞水平觀察汗腺上皮細(xì)胞空泡化的改變情況,比單純涂以和田—高垣氏試劑進(jìn)行定時計數(shù)汗點數(shù)精確度更高。汗點計數(shù)法雖簡單易行,但受外界因素影響大,如:氣溫、濕度、風(fēng)力及人為因素。用汗液定量測定法研究解表方藥,僅能說明麻黃湯具有發(fā)汗作用,其發(fā)汗的機(jī)理和汗液的成分難以確定,該法操作復(fù)雜,要求稱量準(zhǔn)確,費(fèi)時,且實驗難于在同一時間段內(nèi)完成。單純用普通光學(xué)顯微鏡觀察,需用大量的實驗動物數(shù)以排出個體差異存在的汗腺上皮細(xì)胞空泡化的正?，F(xiàn)象,且需經(jīng)PAS(過碘酸雪夫氏染色)、阿爾新蘭、蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染色,排出糖原、粘液和脂肪類在制樣過程中被抽取而致的空泡現(xiàn)象。本課題采用透射電子顯微鏡技術(shù)—半薄切片和超薄切片,不受環(huán)境因素制約,取材快速準(zhǔn)確,實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠,且有統(tǒng)計學(xué)意義,該法不僅從細(xì)胞學(xué)水平,而且從細(xì)胞分子學(xué)水平上動態(tài)地觀察汗腺上皮細(xì)胞的分泌活動情況,為麻黃湯的發(fā)汗解表作用在臨床上運(yùn)用提供強(qiáng)有力的形態(tài)學(xué)依據(jù)。3.2對大鼠足底部麻黃的影響八十年代中期曾有學(xué)者提出這樣的問題——麻黃湯使正常皮膚溫度降低,它的解熱作用究屬汗腺作用、血管作用還是中樞及外周神經(jīng)作用的問題?國外學(xué)者做了實驗將麻黃堿給貓靜注(70mg/只貓),則其后肢足跖放散的水分量增加,這種作用在切斷坐骨神經(jīng)時便消失。說明麻黃堿的發(fā)汗作用是經(jīng)過神經(jīng)途徑進(jìn)行。采用徐守中的方法,觀察麻黃湯對體溫中樞調(diào)定點的影響,結(jié)果表明麻黃湯能明顯降低耳朵溫度、舌下溫度(P<0.05)。發(fā)汗作用機(jī)制可能是作用于下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞,使體溫調(diào)定點下降,通過神經(jīng)途徑,使汗腺分泌增加,從而降低體溫。用20%麻黃煎劑100ml/只貓,皮下注射及30ml/只貓口服,未見有上述作用,應(yīng)用2mg/kg以上口服劑量,方可促進(jìn)大鼠足底部發(fā)汗,提示單味麻黃發(fā)汗作用弱,麻黃的發(fā)汗作用在達(dá)最低起效計量后呈現(xiàn)計量依賴性,有實驗證明麻黃制成水溶性提取物給大鼠口服,結(jié)果顯示在75～300mg/kg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性發(fā)汗作用,濃度越高,發(fā)汗作用越強(qiáng)。麻黃湯君藥為麻黃,主要成分是麻黃堿,屬于混合作用類型,有擬交感胺作用:①麻黃堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)與腎上腺素相似,能直接與腎上腺素能α和β受體結(jié)合,產(chǎn)生擬腎上腺素樣作用;②麻黃堿亦作用于腎上腺素能神經(jīng)末梢,促使去甲腎上腺素的釋放。有研究報道:汗腺、唾液腺、淚腺上存在α受體和M受體,小汗腺的支配神經(jīng)屬交感神經(jīng),但其節(jié)后纖維為膽堿能纖維,麻黃中含有擬腎上腺素能效應(yīng)成分,其作用可直接興奮α受體并可間接促交感神經(jīng)興奮引起腺體分泌增加,乙酰膽堿也能促進(jìn)小汗腺的分泌。麻黃除含麻黃堿外,還含有偽麻黃堿,偽麻黃堿有抑制血管通透性作用,機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)通過交感神經(jīng)系統(tǒng)控制著皮膚血管的口徑,當(dāng)交感神經(jīng)興奮性增大,皮膚小動脈收縮,皮膚血流量因而減少,皮膚溫度降低。麻黃油即麻黃揮發(fā)油是麻黃的又一主要有效成分,有實驗研究,用10%的麻黃油乳劑以每公斤2ml灌胃,對用牛乳引起發(fā)熱的兔有解熱作用,麻黃油可興奮汗腺,使汗腺分泌活動加強(qiáng),對流感病毒(亞甲型,AR8)亦有明顯的抑制作用,對正常小鼠有降溫作用。綜上所述,麻黃湯的發(fā)汗機(jī)理是以中樞神經(jīng)途徑為主,同時也有汗腺和局部血管的協(xié)同作用。3.3第1代生物毛果蕓香堿(又名匹魯卡品Pilocarpine)是植物中提取的生物堿,屬叔胺類化合物,1874年Coutinhou證實咀嚼毛果蕓香屬植物葉可使唾液分泌增加,1875年提取了生物堿,該生物堿能激動M膽堿受體(M-AchR毒蕈堿樣已酰膽堿受體),通過與細(xì)胞膜表面的GTP(三磷酸鳥苷)結(jié)合蛋白的相互作用,跨膜轉(zhuǎn)遞信號,產(chǎn)生興奮或抑制,不改變細(xì)胞膜Na+、Ca+離子通透性,產(chǎn)生M樣作用,對眼和腺體的作用最明顯。毛果蕓香堿滴眼,能產(chǎn)生縮瞳,降低眼內(nèi)壓和調(diào)節(jié)痙攣等作用,對淚腺、胃腺、胰腺、小腸腺和呼吸道粘膜分泌均可增加。另外,付交感神經(jīng)興奮,引起心率減慢,心肌收縮力減弱,全身血管擴(kuò)張,血壓下降,支