蛋白質(zhì)電泳分析

蛋白質(zhì)電泳與分析Proteinelectrophoresisanalysis目錄1電泳技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史2電泳的基本原理3電泳技術(shù)分類4電泳技術(shù)的應(yīng)用5影響電泳遷移率的因素6常用的電泳方法7電泳儀器1電泳技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史1809年俄國(guó)物理學(xué)家Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個(gè)電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動(dòng)，這就是電泳現(xiàn)象。1909年Michaelis首次將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測(cè)定了轉(zhuǎn)化酶和過(guò)氧化氫酶的電泳移動(dòng)和等電點(diǎn)。1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1電泳技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過(guò)研究。從本世紀(jì)50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開(kāi)創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開(kāi)創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。1電泳技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史30多年來(lái)，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗(yàn)生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個(gè)點(diǎn)）的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對(duì)生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即“LastCheck”。由80年代發(fā)展起來(lái)的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視2電泳的基本原理電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子3電泳技術(shù)分類3.1區(qū)帶電泳3.2界面電泳3.3等速電泳3.4等點(diǎn)聚集電泳3.5毛細(xì)管電泳3電泳技術(shù)分類一原理醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。帶電顆粒在電場(chǎng)力作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。由于各種蛋白質(zhì)都有特定的等電點(diǎn)，如將蛋白質(zhì)置于pH值低于其等電點(diǎn)的溶液中，則蛋白質(zhì)將帶正電荷而向負(fù)極移動(dòng)。反之，則向正極移動(dòng)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度與其帶電量、分子的形狀及大小有關(guān)，所以，可用電泳法將不同的蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。3電泳技術(shù)分類二

實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑1．材料：健康人血清或雞血清2．儀器：電泳儀電泳槽3．試劑：（1）醋酸纖維素薄膜；（2）pH8.6巴比妥緩沖液（離子強(qiáng)度0.06～0.07）：取巴比妥0.83克，巴比妥鈉6.38克，加蒸餾水加熱溶解后，定容至500ml。（3）染色液：取氨基黑10B0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸餾水40ml混勻。（4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml混合。（5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合3電泳技術(shù)分類三、實(shí)驗(yàn)方法1．準(zhǔn)備薄膜：將切割整齊的2.5×6cm的薄膜條，浸入巴比妥緩沖液中浸透后，取出，用吸水紙吸去多余緩沖液。2．點(diǎn)樣：仔細(xì)辯認(rèn)薄膜的粗糙面與光滑面，在粗糙面距離薄膜一端1.5cm處，用鉛筆輕輕劃一條直線。用玻棒蘸上血清樣品，涂于蓋玻片邊緣處（邊緣長(zhǎng)度應(yīng)比膜條寬度窄），將此邊緣按壓在直線上。注意：樣品應(yīng)點(diǎn)在薄膜的粗糙面一側(cè)。待血清完全滲入薄膜后，將膜面翻轉(zhuǎn)，點(diǎn)樣面（粗糙面）朝下，置電泳槽中，薄膜點(diǎn)樣端放于負(fù)極一側(cè)。3．電泳：打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)電壓110～130V，電流0.4～0.6mA/cm寬，電泳時(shí)間45～60分鐘，電泳完畢后，關(guān)閉電源。3電泳技術(shù)分類4．染色漂洗：將薄膜從電泳槽中取出，直接浸入染色液中約5分鐘，再轉(zhuǎn)入漂洗液中反復(fù)浸洗3～4次，直至背景顏色脫凈為止。此時(shí)，正常血清蛋白在薄膜上顯示出五條區(qū)帶。從前端至點(diǎn)樣處的方向分別為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。5．定量測(cè)定：時(shí)可將膜條用濾紙壓平吸干，按區(qū)帶分段剪開(kāi)，分別浸在體積0.4mol/L氫氧化鈉溶液中，并剪取相同大小的無(wú)色帶膜條作空白對(duì)照，進(jìn)行比色。或者將干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡2～3分鐘后，取出貼于潔凈玻璃板上，干燥后，即為透明薄膜圖譜，可用光密度計(jì)直接測(cè)定。4電泳技術(shù)的應(yīng)用電泳技術(shù)主要分離各種有機(jī)物和無(wú)機(jī)鹽；也可用于分析某種物質(zhì)純度；還可用于分子量測(cè)定。電泳技術(shù)與其他分離技術(shù)（如層析法）結(jié)合，可用于蛋白質(zhì)的分析，“指紋法”就是電泳與層析法的結(jié)合產(chǎn)物。用免疫原理測(cè)試電泳結(jié)果，可提高對(duì)蛋白質(zhì)的鑒別能力。電泳與酶學(xué)技術(shù)結(jié)合發(fā)現(xiàn)了同工酶，從而對(duì)酶的催化和調(diào)節(jié)功能有了更深入的了解。所以電泳技術(shù)在醫(yī)用科學(xué)中是一項(xiàng)重要的技術(shù)。5影響電泳遷移率的因素5.1遷移率:

是指帶電顆粒在單位電場(chǎng)下泳動(dòng)的速度。

5.2遷移率的影響因素:

內(nèi)在因素

外在因素5.2.1影響遷移率的內(nèi)在因素所帶靜電荷的多少——遷移率與表面電荷成正比。大小和形狀——直徑小而接近于球形，則在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度快。DNA構(gòu)象——一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開(kāi)環(huán)。5.2.2

影響遷移率的外在因素1電場(chǎng)強(qiáng)度:電場(chǎng)強(qiáng)度是指單位長(zhǎng)度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)速度起著十分重要的作用。當(dāng)電壓在500V以下，電場(chǎng)強(qiáng)度在2-10v/cm時(shí)為常壓電泳。電壓在500V以上，電場(chǎng)強(qiáng)度在20-200V/cm時(shí)為高壓電泳。一般，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動(dòng)速度越快2溶液的pH值：溶液的pH決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。溶液的pH離pl越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此