銀杏酚酸提取液乳化及其抑菌活性研究

銀杏酚酸提取液乳化及其抑菌活性研究

目前，銀杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。隨著銀杏產(chǎn)量的提高，銀杏年產(chǎn)量中的大量外包被視為危害，并被污染。據(jù)統(tǒng)計,蘇州市每年約有1250t左右,江蘇省每年約有1萬t左右,而我國每年約有3萬t左右的銀杏外種皮作為廢料棄去,既浪費(fèi)大量資源又造成環(huán)境污染。利用銀杏外種皮制備生物農(nóng)藥,不但可以免除環(huán)境污染,變廢為寶,而且可以提高綠色蔬菜、水果等的無公害質(zhì)量,因此是一項一舉多得,意義重大的工作。目前,國內(nèi)外在銀杏提取物的活性成份研究及開發(fā)方面,偏重于黃酮類和酯類。而銀杏酚酸性成份是制備生物農(nóng)藥的必要成份,因此進(jìn)行酚酸性成份的應(yīng)用研究與市場開發(fā)必將成為一個新的熱點。芽孢桿菌以對外界有害因子的抵抗力強(qiáng)著稱,是土壤中種類和數(shù)量相對穩(wěn)定的細(xì)菌類型。常見的芽孢桿菌有:枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌等。本試驗?zāi)康氖菫榱苏页鲢y杏外種皮提取物對土壤細(xì)菌及芽胞桿菌生長的影響,以作為該提取物應(yīng)用制劑研制的理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1芽孢桿菌bacillussp.bsz10和bsz10菌株的分離和培養(yǎng)銀杏外種皮是由蘇州市東山銀杏種植區(qū)提供的外種皮干制品。芽孢桿菌Bacillussp.BSZ1～Bacillussp.BSZ10菌株由本實驗室從土壤分離而得,從本實驗室保存菌種活化。1.2方法1.2.1高剪切頭制漿銀杏外種皮首先去雜,后放入浸泡液中浸泡,不斷調(diào)節(jié)浸泡液的成份,以使銀杏外種皮溶脹、膨化到接近鮮果狀態(tài)。然后將溶脹、膨化狀態(tài)的外種皮剪碎至一定粒度,稱取定量100g,加入帶有高剪切頭、回流、溫度控制的三口燒瓶中,在一定的溫度下,利用高剪切頭制漿。并按文獻(xiàn)方法提取,提取液經(jīng)壓濾,濾液經(jīng)濃縮后進(jìn)行精制,以除去提取液中的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì),除雜后的濾液濃縮至一定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后,再經(jīng)調(diào)制處理即為成品。1.2.2土壤的制備A.保存菌種的活化:將本實驗保存的芽孢桿菌Bacillussp.BSZ1～Bacillussp.BSZ10共10個菌株用LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24h。B.全菌試驗用干土的制備:取新鮮的土壤,在40℃烘干,經(jīng)研磨機(jī)打碎后過篩,得到含有土壤中全部細(xì)菌類型的土壤。C.含芽孢桿菌土壤的制備:取新鮮的土壤,在40℃溫箱中烘干,經(jīng)研磨機(jī)打碎后過篩,再放入90℃溫箱中持續(xù)烘烤2h,目的是殺死土壤中非耐熱的細(xì)菌,而芽孢桿菌屬耐熱細(xì)菌。D.土壤系列稀釋液的制備:分別稱取B、C兩種土壤各5g,制備土壤系列稀釋度懸液至10-2,備用。1.2.3膜法提取nmf根本培養(yǎng)基液對不同體積分?jǐn)?shù)的乳劑藥液對各菌生長的影響A.液體培養(yǎng)狀態(tài)下藥液原液對芽胞桿菌生長的影響在準(zhǔn)備好的每試管5mL的LB培養(yǎng)基中分別接種50mL的濃度為109CFU芽孢桿菌菌液,同時按體積分?jǐn)?shù)0%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1%,1.2%加入銀杏外種皮提取的藥液原液,并設(shè)加藥不加菌和不加藥不加菌的對照。每試管設(shè)3個重復(fù)。置36℃的恒溫水浴搖床中,以140r·min-1振蕩培養(yǎng)17h,在460nm下測菌液OD值,根據(jù)菌液OD值變化來判定不同體積分?jǐn)?shù)藥液原液對各菌生長的抑制狀況。B.平皿藥液涂布法檢測乳劑藥液對土壤全菌的抑制作用將配好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,待凝后,用含土壤全菌的10-2稀釋度土壤懸液200μL涂布平皿,同時分別用銀杏外種皮提取液的乳劑藥液500μL涂抹平皿,藥液體積分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.5%、2%、10%,36℃放置10min,待平皿表面干燥后,倒置放入36℃的溫箱中培養(yǎng)17h,觀察不同體積分?jǐn)?shù)乳劑藥液作用下菌落的生長狀況。C.平皿藥液涂布法檢測乳劑藥液對土壤芽胞桿菌的抑制作用在配好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后,將加熱處理后含芽胞桿菌的10-2稀釋度土壤懸液200μL涂布平皿,同時用體積分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.5%、2%、10%銀杏外表皮提取液的乳劑藥液500μL涂布平皿,36℃放置10min,待平皿表面干燥后,倒置放入36℃的溫箱中培養(yǎng)17h,觀察不同體積分?jǐn)?shù)乳劑藥液作用下菌落的生長狀況。D.平皿紙片法檢測乳劑藥液對土壤芽胞桿菌的抑制作用在配好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后,將90℃處理后含芽胞桿菌土壤的10-2稀釋度土壤懸液200mL涂布平皿,36℃放置10min,待平皿表面干燥后,將體積分?jǐn)?shù)0%、8.25%、16.5%、33%乳劑藥液的藥敏紙片貼在已涂菌的固體培養(yǎng)基表面,用100%的藥液原液作為陽性對照,放入36℃的溫箱中培養(yǎng)17h,觀察不同體積分?jǐn)?shù)乳劑藥液對芽胞桿菌的抑制作用。2結(jié)果與分析2.1液體培養(yǎng)狀態(tài)下原始藥物對芽細(xì)胞菌生長的影響2.1.1bacarlussp.bsze菌株對藥物的敏感性和生長圖1～10分別為各芽孢桿菌菌株在不同體積分?jǐn)?shù)藥液原液影響下的生長狀況?？傮w來看藥液原液對各芽孢桿菌菌株的生長均表現(xiàn)出抑制作用。在藥物體積分?jǐn)?shù)不斷上升的情況下,相對應(yīng)的芽孢桿菌的生長就下降。但各菌受抑的程度和對藥物體積分?jǐn)?shù)的敏感程度卻不盡相同。圖1中Bacillussp.BSZ1菌株對藥液原液表現(xiàn)出強(qiáng)敏感性,在藥液體積分?jǐn)?shù)為0.2%時就受到較大的抑制,在體積分?jǐn)?shù)遞增到0.4%及以上時更是加大了抑制,直至Bacillussp.BSZ1菌株完全被抑制。圖2中Bacillussp.BSZ2菌株對低體積分?jǐn)?shù)藥液原液不敏感,至藥液原液體積分?jǐn)?shù)為1.2%時菌的生長才大幅受抑。從圖3中可以看出Bacillussp.BSZ3菌株的生長明顯受藥液原液影響的藥物體積分?jǐn)?shù)是從0.6%開始。至藥物體積分?jǐn)?shù)為1.0%、1.2%時甚至出現(xiàn)了溶菌現(xiàn)象。圖4中Bacillussp.BSZ4菌株對藥物的敏感性相似于Bacillussp.BSZ1菌株,對藥液原液也表現(xiàn)出強(qiáng)敏感性,在藥液體積分?jǐn)?shù)為0.2%時菌的生長即受到非常明顯的抑制,從藥物體積分?jǐn)?shù)0.4%始,生長就幾乎受全抑制,但至1.2%也未表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象。圖5中Bacillussp.BSZ5菌株在藥物體積分?jǐn)?shù)0.2%～0.8%階段,其菌株生長的受抑制程度呈均勻下降的趨勢,從藥物體積分?jǐn)?shù)0.8%始生長就受全抑制。圖6中Bacillussp.BSZ6菌株在藥物體積分?jǐn)?shù)為0.2%～0.6%階段中,其生長只輕度受抑,至藥物達(dá)0.8%時,菌株的生長一下子就受到全抑制。圖7中藥液原液對Bacillussp.BSZ7菌株的生長抑制在低體積分?jǐn)?shù)時表現(xiàn)較緩,至0.8%始轉(zhuǎn)為大幅受抑,至1.0%和1.2%時菌的生長受全抑制。圖8中藥物對Bacillussp.BSZ8菌株的明顯生長抑制主要表現(xiàn)是從藥物體積分?jǐn)?shù)0.6%開始,至1.0%菌的生長受全抑制。圖9中藥液原液對Bacillussp.BSZ9菌株的明顯生長抑制也是從藥物體積分?jǐn)?shù)0.6%開始,至0.8%即達(dá)全抑制。圖10中Bacillussp.BSZ10菌株在藥液體積分?jǐn)?shù)為0.6%時生長開始明顯受抑,至藥液體積分?jǐn)?shù)為0.8%～1.2%時都出現(xiàn)了明顯的溶菌現(xiàn)象。2.1.2細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)在受試的藥物體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi),各種芽孢桿菌受銀杏外表皮體積分?jǐn)?shù)提取藥液抑制的情況比較見圖11,可見所有菌株的生長均受該藥液原液的不同程度抑制,從最小的藥物體積分?jǐn)?shù)0.2%始,各菌株即表現(xiàn)出不同程度的受抑現(xiàn)象,并且在受試的藥物體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)各菌株均出現(xiàn)了生長被全抑制的現(xiàn)象。從大的趨勢來看,至藥物體積分?jǐn)?shù)1.2%,所有菌株均無法生長;在藥物體積分?jǐn)?shù)1.0%,除BSZ2菌株外其余菌株已不生長;0.8%是最顯著的藥物影響轉(zhuǎn)折點,有8個菌株已基本不生長,另兩個菌株中,BSZ7菌株已嚴(yán)重受抑,只BSZ2菌株受影響程度最小。同時各菌株受抑制狀況有所不同,BSZ1、BSZ4、BSZ5菌株在藥物體積分?jǐn)?shù)為0.2%始即表現(xiàn)出大幅受抑現(xiàn)象,BSZ3、BSZ8、BSZ9、BSZ10菌株生長的較大幅度受抑是從0.6%藥物體積分?jǐn)?shù)開始,BSZ6、BSZ7菌株生長的大幅受抑是從0.8%藥物體積分?jǐn)?shù)開始,BSZ2菌株對藥物的敏感性最差,至1.2%藥物體積分?jǐn)?shù)才表現(xiàn)出大幅受抑現(xiàn)象。BSZ3、BSZ8、BSZ10在高體積分?jǐn)?shù)藥物作用下表現(xiàn)出不同程度的溶菌現(xiàn)象,尤其是BSZ10菌株溶菌現(xiàn)象明顯。綜上,該藥液原液對從土壤中分離的芽孢桿菌各菌株均存在抑制作用。2.2在固體培養(yǎng)中，藥物對細(xì)菌生長的影響2.2.1細(xì)菌生長的變化平皿藥液涂布法檢測乳劑藥液對土壤全菌的抑制作用結(jié)果見圖12,總的看來在藥物體積分?jǐn)?shù)不斷上升的情況下,相對應(yīng)的全菌生長量逐漸下降。在無藥物的a圖中有呈大片生長的細(xì)菌菌苔,b、c、d中菌苔的范圍逐漸縮小;至e只有零星的菌落生長。2.2.2乳劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對芽孢桿菌生長的影響平皿藥液涂布法檢測乳劑藥液對土壤所含芽孢桿菌的抑制作用結(jié)果見圖13?？梢姀臒o藥物的a至藥物體積分?jǐn)?shù)為10%,隨著乳劑藥液體積分?jǐn)?shù)的遞增,土壤中芽孢桿菌的生長受抑狀況也隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。其變化趨勢與圖12中對全菌的抑制相一致。所不同的是兩者土壤中本身所含的菌量差異。2.2.3菌株抑菌圈的增平皿紙片法檢測乳劑藥液對土壤芽胞桿菌的抑制作用結(jié)果見圖14。由于該藥物經(jīng)濾紙吸附后在固體培養(yǎng)基表面的擴(kuò)散存在一定的局限性,使抑菌圈整體偏小,但仍能看出在藥敏紙片體積分?jǐn)?shù)不斷上升的情況下,相對應(yīng)的對芽孢桿菌各菌株的的抑菌圈就增大;同一體積分?jǐn)?shù)的藥敏紙片對不同芽孢桿菌的抑菌圈的大小不一,即不同菌株對藥物的敏感性存在差異。3銀杏酚酸類農(nóng)藥的抑菌效果銀杏酚酸是一類從銀杏外種皮中提取的酚和酸的統(tǒng)稱,銀杏酚酸類成分按化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同,可分為白果酸、氫化白果酸、氫化白果亞酸、銀杏酚、白果酚等。它們可看作是水楊酸分子在苯環(huán)C6位上連有較長側(cè)鏈的系列化合物。本試驗中按文獻(xiàn)方法提取的即為該系列化合物,銀杏酚酸雖然存在一定的毒性,但只要體積分?jǐn)?shù)控制得當(dāng),其毒性仍比化學(xué)合成類農(nóng)藥要小得多,而且由于其所具有的廣譜抗菌、抗蟲、抗病毒等作用,加之隨著銀杏葉等的開發(fā)利用,銀杏的種植面積正日益擴(kuò)大,使銀杏外種皮成為供應(yīng)量大且廉價的物質(zhì),不失為具良好應(yīng)用前景的植物源農(nóng)藥。本試驗主要應(yīng)用的為藥液原液,其主要目的是檢測該藥劑對土壤中分離的野生型的芽孢桿菌類所具有的抑制作用,雖然在細(xì)菌類中能產(chǎn)芽孢的芽孢桿菌類對外界不良條件具較強(qiáng)的抵抗力,但從本試驗結(jié)果看雖然不同的菌種對藥劑的反應(yīng)不盡相同,但卻均受到該藥劑不同程度的抑制。乳劑藥液為一般投入應(yīng)用時的首選,是將分離的藥劑用一定比例的乳化劑處理所得,目的是使藥劑在噴灑至農(nóng)作物表面時可迅速擴(kuò)散,以使藥劑盡快與農(nóng)作物上的病菌、病蟲等接觸。已報道的銀杏酚酸類抑菌試驗多是用常用的指標(biāo)性菌如大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌等,及植物病菌尤其是真菌類病菌如小麥赤霉菌、番茄灰霉菌、辣椒疫霉菌等,植物病原性霉菌由于能產(chǎn)大量具抗性的孢子,使得根治較困難,其孢子對外界不良條件的抵抗力與芽孢桿菌類所產(chǎn)芽孢具相似的性質(zhì)。從已有的報道看,銀杏酚酸對許多植物上寄生的真菌類病菌具良好的生長抑制作用,這與本文所得結(jié)果是相一致的,即銀杏酚酸對具抗性的微生物同樣具有較好的抑制作用。本試驗所報道結(jié)果中所采用的方法為三種,即液體培養(yǎng)測生長速度法、平皿藥劑表面涂布法和平皿紙片法。在預(yù)試驗中尚有另一種方法,是將藥劑混入固體培養(yǎng)基內(nèi)并在其上接種細(xì)菌,但由于所用菌種均為好氧性細(xì)菌,且為表面接種培養(yǎng),而藥劑由于受固體培養(yǎng)基的制約不易擴(kuò)散,致使試驗效果不佳,因此被淘汰。平皿紙片法同上理,藥物經(jīng)濾紙吸附后在固體培養(yǎng)基表面的擴(kuò)散存在一定的局限性,使抑菌圈整體偏小,不過仍具一定的參考性。因此認(rèn)為該藥物的抑菌作用試驗更適宜采用的方法為液體培養(yǎng)測生長速度法和平皿藥劑表面涂布法。從本試驗結(jié)果看,從銀杏外種皮中提取的銀杏酚酸無論是對土壤