microrna-192、creb、pcreb在癲癇大鼠海馬及難治性癲癇患者中的表達及意義

microrna-192、creb、pcreb在癲癇大鼠海馬及難治性癲癇患者中的表達及意義

癲癇是一種由多種原因引起的慢性腦功能異常的慢性腦疾病，具有高度同步和異常的大腦功能異常。癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死和凋亡、特異性突觸重塑、膠質(zhì)增生及苔蘚纖維出芽等,其中特異性突觸重塑及苔蘚纖維出芽可促進異常興奮性環(huán)路的形成,進而發(fā)展成為難治性癲癇。大量癲癇病理生理研究研究表明,異常的軸突、樹突的生長發(fā)育形成了異常的突觸,這可能是導(dǎo)致異常的興奮性神經(jīng)環(huán)路形成的原因之一,從而促使了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。樹突棘位于突觸后成分中,其形成和降解的動態(tài)變化被認(rèn)為是突觸可塑性的標(biāo)志。Schratt等研究結(jié)果顯示microRNA-134(miR-134)可調(diào)控樹突棘的形態(tài)。CREB是神經(jīng)元可塑性重要的調(diào)節(jié)因子,其磷酸化活性形式對樹突生長和樹突精細結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)起重要作用。而miR-134通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)節(jié)CREB蛋白的表達,miR-134過表達可抑制CREB的翻譯負性調(diào)節(jié)突觸可塑性;反之則增加突觸的可塑性。本研究通過觀察難治性癲癇組與非難治性癲癇組顳葉組織、正常對照與癲癇模型大鼠海馬組織miR-134、CREB、pCREB的表達變化,探討miR-134/CREB/pCREB信號通路在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的可能機制。1材料和方法1.1飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)過程42只清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心【SCXK(渝)2012-0002】,體重(200±20)g,6~8周齡,飼養(yǎng)于環(huán)境溫度22~26℃,濕度50%~60%,12h晝夜循環(huán),自由進食及飲水的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中【SYXK(渝)2010-0002】,所有試驗過程遵照重慶醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定。將實驗動物按隨機數(shù)字表法分為對照組及癲癇點燃后1、3、7、14、30、60d組,每組6只。1.2racine分級癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰127mg/kg,16~20h后注射匹羅卡品35mg/kg(Sigma公司),在注射匹羅卡品30min前注射阿托品1mg/kg,發(fā)作嚴(yán)重程度按照Racine分級方法(0級:無任何反應(yīng);Ⅰ級:面部陣攣,包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級加節(jié)律性點頭:Ⅲ級:Ⅱ級加前肢陣攣;Ⅳ級:Ⅲ級加后肢站立;Ⅴ級:Ⅳ級加摔倒),實驗動物連續(xù)3次達到IV-V級發(fā)作即被認(rèn)為達到癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE),SE點燃后45min腹腔給予地西泮10mg/kg終止發(fā)作,未達到標(biāo)準(zhǔn)的大鼠反復(fù)給予匹羅卡品10mg/kg,每15min一次,直至出現(xiàn)SE為止,每只大鼠總量不超過50mg/kg。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水代替匹羅卡品,其余處理同癲癇組。1.3血藥濃度及病例選擇(1)實驗中所涉及的14例難治性癲癇患者顳葉病灶標(biāo)本來自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院。進行外科手術(shù)的顳葉癲癇患者其臨床表現(xiàn)均達到難治性癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn):正規(guī)使用3種及以上的AES藥物,血藥濃度處于維持水平,使用2年仍不能控制癲癇發(fā)作;每月癇性發(fā)作4次以上;排除其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。病灶病理改變主要為:神經(jīng)元缺失、變性、膠質(zhì)細胞增生,取材部位為顳葉皮質(zhì);患者平均年齡:(20.38±10.22)歲。(2)10例非癲癇對照組標(biāo)本來源于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院神經(jīng)外科,患者為顱腦損傷,顱內(nèi)高壓,需外科開顱減壓者。納入標(biāo)準(zhǔn)為:診斷腦外傷明確,其他非癲癇顱腦疾病引起的顱內(nèi)高壓,需手術(shù)治療,術(shù)后病理檢查腦組織結(jié)構(gòu)正常;無癲癇病史和家族史;取材部位為顳葉皮質(zhì)?；颊咂骄挲g:(36.80±13.01)歲。1.4試劑與檢測方法匹魯卡品(Sigma公司,美國),RNA提取、SYBRPremixExTaqTMII、RNAisoPlus、PrimeScriptRTreagentKi試劑盒(TaKaRa公司,中國大連),U6及miR-134特異性反轉(zhuǎn)錄及PCR引物(南京金斯瑞,中國南京),全蛋白提取試劑盒(凱基公司,中國南京),BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(碧云天公司,中國上海),CREB、pCREB多克隆一抗(CellSignalingTechnology,美國),NPY(武漢三鷹公司,武漢)。1.5免疫組化實驗材料(1)將術(shù)中獲得的人腦顳葉皮質(zhì)標(biāo)本分成兩部分:一份保存于液氮中作為RT-PCR及Westernblot的實驗材料;一份放入4%多聚甲醛中保存24h后石蠟包埋組織,并將組織切成5μm厚度,作為免疫組化實驗材料。(2)造模成功后每組3只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1mL/kg后斷頭取腦,分離出兩側(cè)海馬,立即浸入液氮中分別用于RT-PCR及Westernblot檢測。其余大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后分離大腦,用石蠟包埋后冠狀位切片,厚5μm,用于免疫組織化學(xué)分析。1.6反轉(zhuǎn)錄實驗方法取液氮保存的人顳葉皮質(zhì)標(biāo)本及大鼠海馬組織提取總mRNA。采用RNAisoplus試劑(TaKaRa公司),按操作說明書提取。提取的總RNA樣本在加入RNase-free水完全溶解RNA沉淀后-80℃中保存。RNA的濃度和純度用260/280nm下檢測,260/280nm在1.9~2.20之間。反轉(zhuǎn)錄實驗采用TaKaR的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,步驟為(1)37℃60min;(2)85℃5s。反應(yīng)在96孔PCR板中進行,每個反應(yīng)做3個復(fù)孔。PCR反應(yīng)體系為20μL,RT1μL,上下游引物各0.5μL,SYRBGreen熒光染料(TaKaRa公司)10μL,去離子水8μL。反應(yīng)條件為(1)95℃,30s;(2)95℃,5s,60℃,20s,40個循環(huán)。miR-134和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線保證擴增的效率在90%~110%之間。擴增和溶解曲線及數(shù)據(jù)用Bio-RadCFXManager軟件分析。實時定量PCR雙向引物序列:miR-134:5'-GGGGTGTGACTGGTTGAC-3'(南京金斯瑞,中國),U6:F:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3':R:5'-CGCTICACGAATITGCGTGTCAT-3'。結(jié)果用平均2-ΔΔCT法進行分析。1.7膜上條帶檢測人顳葉皮質(zhì)組織、海馬組織提取全蛋白,根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明提取,BCA法檢測蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白:轉(zhuǎn)膜采用全濕法,按照3張濾紙、PVDF膜、完成電泳的膠、3張濾紙的順序依次排放,250mA電流電轉(zhuǎn)1h;5%脫脂奶粉37℃封閉1h;分別加入PBS稀釋過的marker蛋白(β-actin,1∶1000)、兔多克隆CREB一抗(1∶100)及兔多克隆pCREB一抗(1∶50),4℃冰箱過夜;TBST搖洗10min×4次;加入TBST稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4000),與膜37℃孵育1h;再次TBST搖洗10min×4次;ECL顯色。應(yīng)用QuantityOne圖像分析軟件,計算PVDF膜上條帶的光密度值。用目的條帶的光密度值比相應(yīng)內(nèi)參β-actin條帶的光密度值得到該蛋白在組織中的表達量。1.8正常臨床資料將組織切片在二甲苯中脫蠟,梯度酒精中脫水。自來水沖洗5min,PBS磷酸鹽緩沖液中浸泡3min后于3%H2O237℃反應(yīng)10min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,PBS緩沖液沖洗3min×3次,用枸櫞酸抗原修復(fù),煮沸3min,92~98℃15min,室溫自然冷卻后PBS緩沖液沖洗5min×3次,滴加正常山羊封閉血清,37℃30min;甩去多余血清加入稀釋后的兔多克隆CREB一抗(1∶400),兔多克隆pCREB一抗(1∶100),陰性對照組用PBS代替一抗,4℃冰箱中過夜,第二日37℃孵育60min復(fù)溫,PBS緩沖液沖洗5min×3次,滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗工作液(中杉金橋),37℃30min,PBS沖洗5min×3次,辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(中杉金橋)37℃30min,PBS沖洗5min×3次,DAB顯色,經(jīng)蘇木素復(fù)染,酒精梯度脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。采用奧林巴斯BX51自動圖片采集系統(tǒng)采集圖片。1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS17軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,對計量資料數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,兩組均數(shù)比較采用t檢驗,多組均數(shù)采用單因素方差分析中的LDS檢驗,P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1mir-133的表達水平在大鼠癲癇點燃后72h(0.026±0.014)、7d(0.021±0.007)、14d(0.008±0.005)、60d(0.015±0.004)miR-134的表達水平相對于正常對照組(0.034±0.017)表達明顯降低(P<0.05),14d達到最低,而在1d(0.031±0.018)、30d(0.030±0.012)時間點無明顯差異(P>0.05);在難治性癲癇患者顳葉皮質(zhì)中miR-134的表達(0.062±0.039)較對照組(0.137±0.086)明顯降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。2.2經(jīng)過streambft檢測結(jié)果2.2.1兩組不同時點石壓0.420.05的變化CREB在人顳葉皮質(zhì)及大鼠海馬中均有表達,在癲癇大鼠點燃成功后1d(0.214±0.088)及30d(0.273±0.117)表達較對照組(0.225±0.04)無明顯變化(P>0.05),在3d(0.423±0.123)、7d(0.416±0.079)、14d(0.44±0.054)、60d(0.382±0.052)較對照組明顯增加(P<0.05);人顳葉皮質(zhì)中難治性癲癇組CREB表達(0.335±0.177)較非難治性癲癇對照組表達(0.180±0.068)增加(P<0.05),差異具有顯著性。見圖2。2.2.2組蛋白表達比較pCREB在人顳葉皮質(zhì)及大鼠海馬中均有表達,在癲癇大鼠點燃成功后1d(0.386±0.055)、3d(0.425±0.082)、7d(0.379±0.074)、14d(0.517±0.126)、30d(0.492±0.037)、60d(0.441±0.075)表達較對照組(0.174±0.045)均明顯增加(P<0.05);人顳葉皮質(zhì)中難治性癲癇組pCREB表達(0.43±0.18)較非難治性癲癇對照組表達(0.27±0.115)增加(P<0.05),差異有顯著性。見圖3。2.3免疫組化的結(jié)果2.3.1兩組癲癇模型creb的表達比較癲癇大鼠腦組織的海馬區(qū)CREB陽性表達主要見于齒狀回、CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元胞核。癲癇模型組72h時間點CREB表達明顯多于正常對照組見圖4(彩插3)。人顳葉皮質(zhì)中CREB陽性表達主要存在于神經(jīng)元細胞核中,且癲癇組明顯多于對照組見圖5(彩插3)。2.3.2對ca3區(qū)神經(jīng)元胞核的影響癲癇大鼠腦組織的海馬區(qū)pCREB陽性細胞主要見于齒狀回、CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元胞核。癲癇模型組72h時間點CREB表達明顯強于正常對照組見圖6(彩插2)。人顳葉皮質(zhì)中pCREB陽性表達主要存在于神經(jīng)元細胞核中,且癲癇組明顯多于對照組見圖7(彩插2)。3mir-133在癲癇臨床中的作用顳葉癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其特征為復(fù)發(fā)性癲癇。大量病理研究分析表明,苔蘚纖維出芽(mossyfibersprouting,MFS)和特異性突觸重組是造成難治性癲癇的主要病理基礎(chǔ),其中MFS是突觸重組的主要形式,廣泛存在于難治性癲癇患者標(biāo)本和癲癇動物模型中。氯化鋰-匹羅卡品大鼠是理想的顳葉癲癇模型,急性期表現(xiàn)為癲癇持續(xù)狀態(tài),隨后有大約兩周的潛伏期是異常興奮性環(huán)路形成的關(guān)鍵時期并伴隨動物一生,慢性期主要表現(xiàn)為自發(fā)性反復(fù)發(fā)作,這與人類難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展機制較為相似。眾多研究顯示,microRNA(miR)是一類長20bp左右具有高度保守性的,內(nèi)源性非編碼小RNA,其作為廣泛存在與哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的基因表達調(diào)控因子,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)細胞分化、樹突生長和突觸重組中起重要作用。它主要通過核酸特異性序列的互補結(jié)合,在蛋白質(zhì)翻譯水平降解靶mRNA或抑制其表達,從而起到沉默基因、調(diào)控表達的作用。越來越多研究表明,樹突棘作為突觸后成分,是突觸后興奮性傳導(dǎo)的重要部位,突觸重塑與腦中一些特殊表達的miR密切相關(guān)。miR-134是腦內(nèi)一種特殊的小RNA,廣泛分布于海馬神經(jīng)元上,參與調(diào)控神經(jīng)元的微觀結(jié)構(gòu),負性調(diào)節(jié)樹突棘的大小并通過調(diào)節(jié)樹突功能而參與癲癇的病理發(fā)生過程。miR-134過表達可減小樹突棘的體積。對臨床標(biāo)本檢測中,miR-134在難治性癲癇組表達明顯低于非癲癇組;在動物實驗中,miR-134在癲癇大鼠模型成功點燃后72h開始下降,直到60d仍保持低水平,人及動物標(biāo)本中這種在癲癇慢性期長期保持低水平的狀態(tài)可能與癲癇慢性期重塑后的突觸穩(wěn)定性增加,及穩(wěn)定的異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成有關(guān)。CREB存在于腦內(nèi)所有細胞細胞核中,是轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的成員,參與了許多細胞內(nèi)信號通路的信號傳遞,有研究表明CREB可促進記憶涉及新的突觸聯(lián)系生長或形成。當(dāng)細胞膜受到刺激時可引起胞內(nèi)CREB的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化,而CREB則通過改變靶基因的表達,調(diào)節(jié)神經(jīng)元所有類型蛋白的表達,進而影響單個神經(jīng)功能最終影響整個神經(jīng)回路。在發(fā)育成熟神經(jīng)元中,轉(zhuǎn)錄因子CREB在樹突生長和活性調(diào)節(jié)樹突的精細結(jié)構(gòu)方面起重要作用,其調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟包括二聚體形成,結(jié)合到DNA反應(yīng)原件以及磷酸化。CREB蛋白的生物學(xué)活性受磷酸化的調(diào)控,磷酸化作用可以增強CREB的轉(zhuǎn)錄活性。miR-134通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)節(jié)CREB蛋白的表達,在正常狀態(tài)下,miR-134對CREB蛋白的表達起抑制作用,miR-134表達增加,對CREB的抑制加強;反之,miR-134表達降低對CREB蛋白的翻譯抑制作用解除導(dǎo)致CREB表達升高,并增加其磷酸化的功能活性形式(pCREB)含量,具有功能活性的pCREB可促進下游miR-132表達上調(diào)進而激活相關(guān)信號通路,導(dǎo)致細胞骨架肌動蛋白聚合,增加樹突棘的密度及體積最終調(diào)節(jié)突觸的可塑性,促使苔蘚纖維出芽形成異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)致癲癇長期反復(fù)發(fā)作及耐藥。在癲癇臨床標(biāo)本及動物模型中CREB與pCREB表達較對照組均明顯且保持上升,CREB磷酸化