應(yīng)用rna干擾技術(shù)抑制結(jié)腸癌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)

應(yīng)用rna干擾技術(shù)抑制結(jié)腸癌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)

血管再生對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)非常重要。許多生長(zhǎng)因子參與了血管再生，尤其是血管再生a。VEGF是一個(gè)45kDa的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子,可以被低氧誘導(dǎo)因子1a所誘導(dǎo)而合成增加,它通過(guò)與其酪氨酸激酶受體,特別是VEGFR-2結(jié)合,參與血管再生的許多關(guān)鍵步驟,包括內(nèi)皮細(xì)胞增生、侵蝕、遷移和存活,以及血管的通透性。VEGF可以被大多數(shù)腫瘤分泌,包括肺、胃腸道、腎、胸腺、膀胱、卵巢和宮頸,VEGF在體內(nèi)的表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展和侵蝕相關(guān)。RNA干擾技術(shù)仍然是目前研究的熱點(diǎn),由于它們具有較強(qiáng)的序列特異性,并能有效的抑制靶基因的表達(dá),故已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療和功能基因組學(xué)的研究中。已有研究應(yīng)用siRNA抑制VEGF的表達(dá),來(lái)治療結(jié)腸癌、前列腺癌和肝癌,并取得了明顯的效果。由于并不是所有與靶基因互補(bǔ)的序列都能產(chǎn)生強(qiáng)的RNA干擾作用,故在其走向臨床應(yīng)用前,必需有大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選,以獲得更有效的序列,因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn),擬通過(guò)RNA干擾抑制結(jié)腸癌HT29細(xì)胞VEGF基因的表達(dá),為下一步探討VEGF基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用,以及抗腫瘤RNA干擾藥物開(kāi)發(fā)的研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1免疫熒光檢測(cè)試劑質(zhì)粒pTZU6+1,內(nèi)含人U6啟動(dòng)子Ⅲ,由美國(guó)UniversityofMichiganDr.DavidEngelke饋贈(zèng);結(jié)腸癌細(xì)胞HT29均由本實(shí)驗(yàn)室提供;細(xì)胞培養(yǎng)用血清為國(guó)產(chǎn)四季青新生牛血清,1640培養(yǎng)基為本室提供;寡核苷酸DNA片段及引物合成由上海英俊公司完成,測(cè)序由上海英俊公司完成。T4DNA連接酶、內(nèi)切酶和Marker為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取采用Qiagen公司的去內(nèi)毒素大量提取試劑盒,轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó)Invitrogen公司的脂質(zhì)體LipofectaminTM2000,其稀釋液為Opti-MEM。RT-PCR檢測(cè)用Qiagen公司的一步法試劑盒,細(xì)胞總RNA提取用Qiagen公司的RNeasyMinikit試劑盒。免疫熒光檢測(cè)試劑盒SABC-Cy3購(gòu)于武漢博士德公司,第一抗體小鼠抗人VEGF多抗購(gòu)于北京中山公司,Cy3熒光標(biāo)記的兔抗小鼠二抗購(gòu)于武漢博士德公司。Westernblotting所需一抗,小鼠抗人VEGF多抗和小鼠抗人Actin,二抗,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG,均購(gòu)于北京中山公司,辣根過(guò)氧化物酶的底物為美國(guó)Pierece公司SuperSignal化學(xué)發(fā)光底物,硝酸纖維膜(NC膜)購(gòu)于德國(guó)Roche公司。Northern雜交用α-32P-dATP購(gòu)于北京福瑞生物技術(shù)工程公司,DNA探針標(biāo)記采用美國(guó)Amersham公司隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒MegaprimeDNAlabelingsystems進(jìn)行,尼龍膜為德國(guó)Roche公司的HybondTMN+尼龍膜。凝膠成像和圖像分析采用英國(guó)劍橋Synoptics有限公司生物影像系統(tǒng)中的geneGenius和GeneTools軟件(版本3.05)進(jìn)行。采用日本OlympusCK-40倒置熒光顯微鏡和美國(guó)MediaCybemeticsImage-ProPlusv5.1進(jìn)行熒光檢測(cè)和圖像分析。1.2方法1.2.1vegf基因缺失菌株的構(gòu)建抗VEGF的RNA干擾靶區(qū)選擇參照E-RNAi網(wǎng)上提供的服務(wù)完成(http://e-rnai.dkfz.de/),先將VEGF的mRNA序列提交,得到全部的有效序列,選出兩個(gè)得分較高且不含連續(xù)三個(gè)以上A的序列作為最終的VEGF靶序列,它們分別是:V1:TGAAGTTCATGGATGTCTATC和V2:ACATCACCATGCAGATTATGC,分別位于VEGF基因的122～142和302～322位。將其設(shè)計(jì)成能在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成反向互補(bǔ)且以TTCG為環(huán)的小發(fā)夾樣RNA。先人工合成寡核苷酸DNA片段,在含200mmol/LNaCl的退火緩沖液中進(jìn)行退火,連接到pTZU6+1載體上,構(gòu)建成抗VEGF基因的pShRNA-V1和pShRNA-V2,經(jīng)酶切鑒定后,再測(cè)序證實(shí)。以抗綠熒光蛋白(GFP)的shRNA表達(dá)載體(pShRNA-GFP)作為無(wú)關(guān)干擾對(duì)照,GFP的靶區(qū)為GCTGACCCTGAAGTTCATC。1.2.2psql-4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體將pShRNA-V1和pShRNA-V2分別轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞,以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞或以不表達(dá)shRNA的空載體pTZU6+1的轉(zhuǎn)染作為未干擾陰性對(duì)照,以pShRNA-GFP的轉(zhuǎn)染作為無(wú)關(guān)干擾對(duì)照,轉(zhuǎn)染方式按LipofectaminTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,即當(dāng)細(xì)胞90%以上融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,先用稀釋液Opti-MEM將質(zhì)粒和脂質(zhì)體稀釋,再將二者混合,室溫孵育20min后,直接加于含血清但不含抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中即可。轉(zhuǎn)染劑量參照我們以前優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行,即對(duì)100ml培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí),pShRNA表達(dá)載體或空載體pTZU6用5μg,脂質(zhì)體LipofectaminTM2000用8μl。轉(zhuǎn)染后48～72h后,收集細(xì)胞進(jìn)行下游檢測(cè)。1.2.3psbs--rna酶法胰酶消化收集細(xì)胞,細(xì)胞沉淀用10mlPBS漂洗一次,以后的操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,產(chǎn)物用50μl無(wú)RNA酶的水溶解,-80℃中保存,避免反復(fù)凍融。1.2.4vegf基因片段的擴(kuò)增采用Prime3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),其引物如下:VEGF的引物為,上游:5′-ctacctccaccatgccaagt-3′,下游:5′-aaatgctttctccgctctga-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為411bp,退火溫度為55℃,用一步法RT-PCR將其擴(kuò)增出,電泳觀察產(chǎn)物的大小與預(yù)期相符后,將產(chǎn)物裝入pGEM-T載體上,再測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為所需的VEGF基因片段。半定量檢測(cè)時(shí),以hGAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)參,hGAPDH的上游引物為5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′,下游引物為5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為240bp(678bp～918bp)。在一個(gè)總體積為25μl的反應(yīng)體系中,同時(shí)加入VEGF和GAPDH兩對(duì)引物,總RNA模板加1μl,逆轉(zhuǎn)錄條件為50℃,30min,PCR的退火溫度為55℃,循環(huán)數(shù)為24,取5μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳,成像后用GeneTools軟件進(jìn)行定量分析。1.2.5vegf片段的標(biāo)記25μg細(xì)胞總RNA上樣電泳于1.2%的甲醛變性凝膠中,再過(guò)夜轉(zhuǎn)移至尼龍膜上,80℃干烤2h固定后,42℃雜交過(guò)夜,探針為α-32P-dATP標(biāo)記的VEGF片段,標(biāo)記方法按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。尼龍膜經(jīng)漂洗后,-80℃曝光48～72h。以凝膠電泳中總RNA的量作為內(nèi)參,來(lái)恒定細(xì)胞總數(shù)。1.2.6封閉正常羊肉干轉(zhuǎn)染48h后,將24孔板細(xì)胞用PBS洗滌一次,加4%多聚甲醛固定,再用PBS漂洗;加3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,用PBS漂洗后,再用正常山羊血清封閉,室溫1h。加入北京中杉公司鼠小鼠抗人VEGF多抗(1∶500稀釋)37℃孵育2h,經(jīng)PBS漂洗后,加入Cy3-標(biāo)記的兔抗小鼠二抗,37℃孵育1h,PBS漂洗后,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,熒光顯微鏡下(波長(zhǎng)568～574nm)觀察陽(yáng)性細(xì)胞并照相,陽(yáng)性細(xì)胞呈鮮紅色,用Image-ProPlus軟件計(jì)算熒光亮度和細(xì)胞總數(shù),以總熒光亮度與細(xì)胞總數(shù)的比值來(lái)反映VEGF表達(dá)水平。1.2.7vegf-計(jì)劃免疫法檢測(cè)免疫組化收集轉(zhuǎn)染后72h的HT29細(xì)胞,用10mlPBS洗兩遍,細(xì)胞沉淀用60μl蛋白上樣緩沖液重懸混勻,煮沸5min,離心12000r/min,10min,取上清20μl加樣于10%SDS凝膠,90V恒壓,電泳2h,通過(guò)電轉(zhuǎn)方式,將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上,將NC膜用封閉液封閉1h,于抗VEGF多克隆抗體中40℃過(guò)夜孵育,用200mlPBS漂洗3次,室溫下在兔抗小鼠二抗中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,加入1ml化學(xué)發(fā)光底物,2min后,于發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)并成像。NC膜再用200mlPBS漂洗3次,于抗Actin抗體中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,室溫下在兔抗小鼠二抗中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,加入1ml化學(xué)發(fā)光底物,5min后,再于發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)并成像。2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒和空載體的鑒定重組質(zhì)粒由于插入序列使原SalI酶切位點(diǎn)消失,故不能被SalI切開(kāi);重組質(zhì)粒和空載體經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切,分別產(chǎn)生2800bp+395bp及2800bp+352bp的片段,可以通過(guò)電泳看出二者之間的差別,以此進(jìn)行重組鑒定,最后測(cè)序證實(shí)序列正確。2.2egf基因片段先通過(guò)電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物電泳的位置與預(yù)期411bp相符,再將其裝入T載體上,測(cè)序證實(shí)為所需的VEGF基因片段。利用RT-PCR檢測(cè)VEGF基因表達(dá)受抑情況,如圖1,2所示,在HT29細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染pShRNA-GFP相比,pShRNA-V1和V2均可以明顯抑制VEGF基因的表達(dá),GeneTools軟件定量分析顯示,pShRNA-V1和V2的抑制率分別為42%和40%。2.3vegfmna的抑制率在HT29細(xì)胞中,如圖3,4所示,以凝膠電泳中總RNA為內(nèi)參,GFP為無(wú)關(guān)序列干擾組,V1和V2組VEGFmRNA的抑制率分別為87%和89%。2.4胞漿內(nèi)延遲表達(dá)如圖5,6所示,免疫熒光檢測(cè)顯示,在HT29細(xì)胞中,VEGF表達(dá)主要以胞漿內(nèi)彌漫分布為主,色澤鮮紅;與無(wú)關(guān)干擾序列pTZU6-GFP和陰性對(duì)照pTZU6+1相比,pTZU6-V1和V2能明顯抑制VEGF蛋白的表達(dá),其抑制率分別為67%和73%。2.5psqla-pv、vdvp對(duì)vegf蛋白表達(dá)的影響如圖7,8所示,Westernblotting顯示,在HT29細(xì)胞中,與陰性對(duì)照pTZU6+1和無(wú)關(guān)干擾序列pShRNA-GFP相比,pShRNA-V1和V2能明顯抑制VEGF蛋白的表達(dá),其抑制率分別為69%和82%。3rna干擾對(duì)vegf基因表達(dá)的影響血管再生是在預(yù)存血管床的基礎(chǔ)上產(chǎn)生新生毛細(xì)胞血管的過(guò)程,這一過(guò)程需要多種細(xì)胞因子參與。這一過(guò)程的不可控制,是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。雖然一些蛋白,如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子和成纖維生長(zhǎng)因子已被證實(shí)是血管再生的刺激物,但最重要血管再生生長(zhǎng)因子是VEGF,它在人類(lèi)的許多腫瘤中是過(guò)量表達(dá)的。誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的機(jī)制有許多,其中缺氧長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是VEGF潛在的誘導(dǎo)劑。研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論術(shù)前有無(wú)轉(zhuǎn)移,手術(shù)后血清VEGF水平明顯降低,這從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF可能是大腸癌血清VEGF的主要來(lái)源。研究表明,VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖;增加血管通透性;促進(jìn)血管支持物的生成;抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡的功能。由于VEGF的功能強(qiáng)大,故已成為腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。另外,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)VEGF的高表達(dá)還與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和眼底血管病變相關(guān),故已有研究通過(guò)抑制VEGF表達(dá)來(lái)治療這些疾病,并取得了顯著的效果。RNA干擾作為一種新型的生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多領(lǐng)域和多學(xué)科的研究中,并取得了顯著的效果。已有研究通過(guò)RNA干擾技術(shù),抑制結(jié)腸癌、前列腺癌和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的VEGF基因的表達(dá),并發(fā)現(xiàn)VEGF的抑制可以使腫瘤細(xì)胞的增殖能力減弱,腫瘤內(nèi)新生血管減少,故認(rèn)為針對(duì)VEGF基因進(jìn)行的RNA干擾,是一種有效的抗腫瘤方式。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中,也發(fā)現(xiàn)針對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞VEGF的兩種RNA干擾序列能有效抑制VEGFmRNA和蛋白的