糖尿病對心肌缺血預處理及二氮嗪預處理效果的影響

糖尿病對心肌缺血預處理及二氮嗪預處理效果的影響

缺損預處理（ipc）是迄今為止最有效的身體內源性保護機制。二氮基吡啶預處理（dpc）可產生與ipc對應的心肌保護作用1。目前還沒有確定ipc和dpc是否在糖尿病狀態(tài)下對心肌有相同的保護作用。IPC的信號傳導途徑雖然已被廣泛接受,但其確切機制尚待進一步深入探索。有文獻［2］證明,去甲腎上腺素預處理能誘導心肌組織NO、一氧化氮合成酶(NOS)高表達,其對供心具有明顯的保護效應,心肌NO、NOS的表達可能是去甲腎上腺素預處理發(fā)揮供心保護作用的機制之一。NO在調節(jié)心臟功能中起非常重要的作用,NO既能參與心肌肥大、心肌細胞的凋亡、又能參與心肌缺血再灌注組(I/R)和IPC等過程［3］。NO可影響線粒體呼吸鏈功能,文獻［4］表明,這一作用可能是間接地通過環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)發(fā)揮的作用。二氮嗪可以使線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)開放,有激活內源性心肌保護機制的作用,還有對抗心肌缺血以及對抗心肌缺氧性損傷的作用［5］。Han等［6］首次證實NO-cGMP信號通路通過激活KATP通道的保護作用。然而有關糖尿病心肌經歷IPC和DPC時NO-cGMP信號通路變化特征的研究報道甚少。本文應用離體心臟缺血再灌注模型,探討糖尿病心肌經IPC、DPC后NO、cGMP和NOS的變化,深入研究IPC及DPC的機制,為臨床應用奠定理論基礎。大鼠心肌缺血情況測量1.實驗動物及材料糖尿病及非糖尿病SD系雄性大鼠各40只(購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心),體質量260~330g。糖尿病大鼠制作方法:腹腔注射鏈佐星(STZSigma公司)60mg/kg,2d后測血糖≥11.1mmol/L為造模成功。所有大鼠飼養(yǎng)條件一致。2w后行心臟離體實驗。自南京建成生物工程研究所購買NO、超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒。cGMP放免分析試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學同位素室。全自動生化分析儀(Beckman)。小動物呼吸機(DH-140型,購自浙江醫(yī)科大學),心電圖機(NihonKonden型,購自上海KONDEN醫(yī)用電子儀器廠)。LS5801液閃計數儀(美國Backman公司)。血糖儀(中國強生醫(yī)療器械有限公司)。2.制備離體心臟Langendorff模型腹腔注射戊巴比妥(5mg/kg)后,肝素化,開胸取出大鼠心臟,放置在4℃改良Krebs-Henseleit(K-H)液中洗凈,迅速轉移、固定于離體心臟Langendorff灌流裝置上。結扎雙側肺靜脈,以80mmHg(1mmHg=0.133kPa)恒定壓力灌流。缺血期間關閉氣體。3.分組隨機將非糖尿病及糖尿病大鼠各分為5組,每組8只:①對照組(Con組):僅行全心灌流120min,不做其他處理;②I/R組:心臟平衡灌流30min,缺血30min,再灌注K-H液60min;③IPC組:缺血30min前,心臟平衡灌流10min,經2次缺血5min再灌5min后,余同I/R組;④DPC組:心臟平衡灌流10min,2次灌注含二氮嗪(濃度為100μmol/L)的K-H液5min,間隔復灌K-H液5min,余同I/R組。⑤二甲基亞砜組(DMSO組):二氮嗪用DMSO取代,過程與DPC組處理相同。4.指標測定①冠狀動脈流出液CK含量:采用全自動生化分析儀比較缺血前和復灌后流出液中的CK含量。②心肌MDA及SOD含量:取0.5g心尖肌,制成組織勻漿(濃度10%),按說明書用TBA法測MDA,用鄰苯三酚自氧化法測SOD活性。③心肌cGMP含量:方法采用放免法,結果以pmol/g表示。④NO含量:采用硝酸還原酶法。根據波長530nm處測量吸光度值計算NO含量,單位用μmol/g表示。⑤NOS含量:按照試劑盒說明書方法通過721型分光光度計于波長530nm處測量吸光度計算NOS活性。單位用U/mg表示。⑥線粒體評分:制作電鏡切片,對線粒體進行Flameng評分。方法:每組隨機觀察5個視野(每視野有20個線粒體),計算每個視野中線粒體評分的平均數,5個視野的均值即為Flameng評分。5.統計學方法采用SPSS15.0統計學軟件。計量數據用均數±標準差表示,進行重復測量單因素方差分析比較。以P<0.05為差異有統計學意義。1.血糖濃度糖尿病組平均血糖濃度為(15.8±4.50)mmol/L,非糖尿病組平均為(4.32±1.33)mmol/L,兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。2.冠狀動脈流出液CK含量各組缺血前CK含量差異無統計學意義(P>0.05)。再灌注后CK含量比較(與I/R比較):非糖尿病大鼠的IPC組和DPC組CK含量明顯降低(P<0.01);而糖尿病大鼠的IPC組和DPC組無明顯降低(P>0.05,圖1)。3.心肌MDA和SOD含量:與I/R組相比較,非糖尿病大鼠的IPC組和DPC組MDA含量明顯降低(P<0.01),而糖尿病組差異無統計學意義(P>0.05)。非糖尿病大鼠IPC組和DPC組SOD含量明顯增高(P<0.01),而糖尿病組無變化(P>0.05,圖2~3)。4.心肌cGMP、NO和NOS含量與I/R組相比較,非糖尿病大鼠的IPC組及DPC組比I/R組明顯增加(P<0.01);而糖尿病組大鼠差異無統計學意義(P>0.05,圖4~6)。5.Flameng評分:非糖尿病大鼠IPC和DPC組較Con組和I/R組明顯減低(P<0.05)。糖尿病大鼠的IPC和DPC組較I/R組未見明顯改變(P>0.05,圖7)。線粒體超微結構顯示:非糖尿病和糖尿病大鼠的Con組和DMSO組線粒體雙層膜存在,無明顯腫脹,心肌胞核正常;非糖尿病大鼠IPC組和DPC組線粒體中度腫脹,嵴稀疏、紊亂,核膜皺褶出現;非糖尿病和糖尿病大鼠I/R組及糖尿病IPC、DPC組線粒體質量度腫脹,嵴稀疏、斷裂,呈空泡樣改變,核膜皺褶明顯(圖8)。心肌缺血損傷與氧自由基有密切關系,氧自由基(ROS)損傷是心肌缺血或再灌注損傷的重要發(fā)病機制之一［7］。本研究結果顯示:非糖尿病大鼠的IPC組心肌梗死面積明顯降低,MDA明顯減少,SOD明顯增加,DPC有相同的作用。而對糖尿病大鼠,IPC及DPC均未使上述指標得到明顯改善。同時我們觀察到:非糖尿病大鼠的IPC組、DPC組心肌NO、cGMP及NOS含量明顯增加,而在糖尿病組心肌NO、cGMP及NOS含量未見明顯增加?？梢?IPC及DPC對非糖尿病大鼠均有明顯的心肌保護作用,而對糖尿病大鼠心肌的保護作用均受到抑制。我們推測糖尿病抑制IPC及DPC的心肌保護作用,可能與NO-cGMP信號通路的表達受到抑制有關。目前較為公認的IPC作用機制是細胞內信號傳導途徑,包括觸發(fā)物質、中介物質和效應子3個環(huán)節(jié)?！坝|發(fā)物質”如NO、前列腺素、腺苷、緩激肽等;“中介物質”如蛋白激酶C(PKC);“效應子”主要為KATP通道。NO產生的反應性氧物質可能是激發(fā)產生IPC效應的信號物質。研究表明,由NO和KATP通道產生心臟保護作用的機制可能包括兩種級聯反應方式。某些NO供體藥物能夠增強KATP通道及其開放劑如二氮嗪的活性,這一作用是通過可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的激活使cGMP含量增加,再通過磷酸肌醇反應以及激活cGMP依賴蛋白激酶兩條途徑激活PKC,導致KATP通道活化。而高血糖本身就是一種特別有害的狀態(tài),它可以使線粒體生成的超氧化物增多,后者可與NO發(fā)生化學反應生成過氧化氮,因而降低NO的保護作用。高血糖狀態(tài)還可通過抑制內皮型一氧化氮合酶使NO生成減少。糖尿病時由于糖異生作用加強,使葡萄糖攝取和氧化功能障礙,細胞內大量積聚TG和游離脂肪酸等脂滴顆粒,代謝產物積聚可導致KATP通道活性降低。高血糖使蛋白質糖基化與氧化過程加劇,全身各種蛋白質糖基化形成晚期糖基化終末產物,后者可與多種受體結合其中重要的受體是晚期糖基化產物受體。細胞表面的晚期糖基化產物受體與晚期糖基化終末產物結合,使細胞內ROS增加,ROS可與KATP通道的硫