血凝時間與凝血酶時間的相關(guān)性研究

血凝時間與凝血酶時間的相關(guān)性研究

經(jīng)典的凝血理論認為，凝血過程有兩種方式。以往認為內(nèi)在途徑的啟動環(huán)節(jié)——接觸激活系統(tǒng)并不參與體內(nèi)凝血過程。目前較為盛行的凝血學(xué)說是兩階段學(xué)說,即組織因子途徑(外在途徑)負責(zé)凝血過程的啟動,截短的內(nèi)在途徑負責(zé)凝血過程的放大。在凝血瀑布形成過程中,凝血酶正反饋作用是關(guān)鍵因素,而其中一個重要反饋點XI因子是兩條途徑的銜接點。激活部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)均為臨床上檢測經(jīng)典內(nèi)、外凝血途徑的常用試驗。為尋求一個試驗同時反映凝血過程的兩個階段的方法,近年我們已利用玉米胰蛋白酶抑制物(CTI)抑制凝血因子XIIa(FXIIa),證明用稀釋的凝血活酶時間可反映兩階段凝血過程。但是,對影響FXIIa受抑稀釋凝血活酶時間(FXIIai-DTT)試驗各種因素及其臨床意義尚不清楚。本研究旨在了解各種抗凝劑、各種制備血漿和某些影響纖溶過程藥物對試驗的影響,并觀察FXIIai-DTT與PT、APTT的相關(guān)性。材料和方法1.cti、抑肽酶和羧基芐胺乏因子VIII血漿、APTT試劑盒、兔腦凝血活酶(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所),CTI(美國EnzymeResearchLab),抑肽酶(北京東亞免疫技術(shù)研究所),對羧基芐胺(湖南洞庭制藥廠)。2.不同抗凝劑治療ppp的制備(1)所有試驗均用一次性塑料注射器抽取空腹靜脈血液。按9份體積全血與1份體積0.13mol/L枸櫞酸三鈉比例混勻抗凝,3500r/min離心20min,吸取上層液即貧血小板血漿(PPP),用1.5mlEppendorf管分裝,即用或凍存于-70℃冰箱備用。(2)正常血漿:在30份靜脈血(本院健康學(xué)生和教師提供)0.13mol/L枸櫞酸三鈉抗凝、離心,提取PPP,即成正常單個血漿。取等同正常單個血漿進行混合,即成正?；旌涎獫{。(3)儲存血漿和硫酸鋇吸附血漿:按參考文獻制成。(4)不同抗凝劑制備血漿:另抽5名健康成人靜脈血,每份血分別等同注入含0.13mol/L枸櫞酸三鈉,0.1mol/L草酸鈉,1%EDTA-Na2溶液和20U/ml肝素;4支試管中抗凝劑與靜脈血體積比為1∶9,混勻抗凝、離心,提取PPP,每種均為5份。(5)患者血漿:血漿標本33份取自湘雅醫(yī)院住院患者,其中急性心肌梗死(AMI)經(jīng)冠脈造影確診的18份,急性缺血性腦卒中(AIS)經(jīng)CT掃描確診的15份。血標本均在發(fā)病24h內(nèi)采取,抗凝為0.13mol/L枸櫞酸三鈉,血漿制備方法與正常血漿相同。3.凝血活酶pt(1)APTT:按廠家試劑盒附說明書操作。(2)PT:按參考文獻進行。(3)FXIIai-DTT:同PT測定。但凝血活酶濃度僅為正常血漿PT試驗1‰,即1∶1000倍稀釋。試驗前先向待測血漿中加入CTI(終濃度為25μ/ml)以抑制FXIIa活性。4.數(shù)據(jù)處理因素組間比較血漿凝固時間數(shù)據(jù)用ˉx±sxˉ±s表示,不同處理因素組間比較采用方差分析,若F>0.05,則以q檢驗進行兩兩比較。對FXIIai-DTT與PT、APTT間的關(guān)系進行相關(guān)分析。結(jié)果1.i-dtt、pt、aptt的s30份健康成人枸櫞酸三鈉抗凝所提取的PPP,分別測定PT、APTT和FXIIai-DTT凝固時間。FXIIai-DTT(81.3±8.9)s,PT(12.9±1.7)s,APTT(37.1±3.5)s。FXIIai-DTT與PT、APTT間的相關(guān)系數(shù)分別為0.83和0.87(均P<0.01)。說明在不同個體間無論是PT還是APTT的變化,均可相應(yīng)出現(xiàn)FXIIai-DTT變化,即FXIIai-DTT的長短可反映PT、APTT的長短。2.u3000酸鈉凝固時間5份健康人血采用不同抗凝劑提取PPP血漿,所測的FXIIai-DTT、PT和APTT見表1。結(jié)果表明4種抗凝劑對3項檢測指標產(chǎn)生的影響均不相同。2U/ml肝素對血漿凝固影響作用最強,無論對PT還是對APTT和FXIIai-DTT,其凝固時間均明顯長于其他3種抗凝劑,1%EDTA-Na2影響強度次之;0.1mol/L草酸鈉影響又較0.13mol/L枸櫞酸三鈉的時間明顯延長。但除0.1mol/L草酸鈉和0.13mol/L枸櫞酸三鈉抗凝血的PT差異不明顯(P>0.05)外,3種抗凝劑所測得的其余指標差異均有顯著意義(均P<0.01)。從臨床實用性考慮,0.13mol/L枸櫞酸三鈉作為抗凝劑較為合適。3.不同阻凝劑含量的血漿中凝血因子的檢測結(jié)果正?；旌涎獫{按不同體積比例分別與硫酸鋇吸附血漿、儲存血漿和乏FVIII血漿混合,測得FXIIai-DTT與PT、APTT的結(jié)果(表2)顯示,隨著3種不同凝血因子缺乏血漿比例含量的增大,血漿中凝血因子隨之減少,血漿凝固所需時間延長。但3種不同乏凝血因子血漿的檢測結(jié)果則不相同,其中PT延長以硫酸鋇吸附血漿影響最為顯著,儲存血漿次之,乏FVIII血漿幾乎無影響;而APTT則均呈劑量關(guān)系延長。無論PT還是APTT延長,或者兩者都延長時,可發(fā)現(xiàn)FXIIai-DTT也延長。說明血漿中凝血因子含量的減少,可在FXIIai-DTT試驗中得以反映。此外本試驗結(jié)果顯示,當(dāng)儲存血漿和乏FVIII血漿比例在20%或以下時,其血漿凝固時間可正常,證明正常血漿中凝血因子有足夠的生理貯備。4.羧基芐胺化合物類化合物pge對pge-tt、pt和aptt變化在枸櫞酸三鈉制備的混合血漿中分別加入抑肽酶(終濃度為200U/ml)和對羧基芐胺(終濃度為0.1g/ml),測定FXIIai-DTT、PT和APTT變化,結(jié)果(表3)顯示,抑肽酶和對羧基芐胺對PT、APTT影響不明顯(P>0.05),但使FXIIai-DTT延長(P<0.01)。5.凝固時間相關(guān)指標18份AMI和15份AIS患者血漿3項指標結(jié)果(表4)顯示,AMI和AIS患者血漿凝固時間較混合血漿加快,表現(xiàn)為FXIIai-DTT、PT及APTT均縮短,其相關(guān)性具有顯著性差異(均P<0.05)。說明其血漿中凝血因子的活性或含量比正?；旌涎獫{高。重新設(shè)計凝血因子漿凝血過程,見表1臨床上以APTT和PT分別檢測內(nèi)、外途徑凝血過程中凝血因子含量及功能變化,但并不能反映體內(nèi)生理凝血全過程。臨床和試驗均表明,接觸系統(tǒng)(由高分子量激肽原、前激肽釋放酶與XII因子組成)蛋白缺乏或缺陷在體內(nèi)并不引起出血表現(xiàn),相反這3個蛋白的純合子缺乏患者存在血栓傾向。APTT試驗中,加入外源性帶負電荷的硅藻土或白陶土,可通過接觸系統(tǒng)活化而致系列凝血因子的激活,產(chǎn)生血漿凝固,臨床常以該試驗時間延長判斷FVIII、FIX和FXI缺乏或嚴重的功能障礙。PT試驗則以加入大量的組織因子(不同來源的凝血活酶)而致外在途徑的凝血因子激活,產(chǎn)生血漿凝固。實際上,在生理情況下,血管壁損傷引起少量組織因子激活即可啟動凝血過程,已證明生理凝血是通過凝血酶正反饋活動進行的。即起始的微量凝血酶除可激活血小板外,還可激活FXI、FVIII、FV等,通過內(nèi)在途徑維持放大凝血過程,使凝血酶足量生成而導(dǎo)致血液凝固。近來的資料證實,凝血酶對FXI的激活具有重要意義。FXIIai-DTT試驗即以此為依據(jù)而設(shè)計,它不僅反映了低濃度組織因子對外在途徑的啟動,而且反映微量凝血酶通過“截短”的內(nèi)在途徑(由FXI起始)的放大,因此該試驗可反映參與兩條經(jīng)典凝血途徑的凝血因子的功能狀態(tài)。我們曾報道FXIIai-DTT試驗?zāi)軌蚍从衬^程的兩階段變化。本研究不但進一步支持FXIIai-DTT試驗的結(jié)論,而且FXIIai-DTT與PT和APTT間存在著一定的正相關(guān)關(guān)系(r=0.83,P<0.01)。此外,不同個體間3項指標值有差異,而同一個體的血樣本在不同時間所測得的值也不同,但是FXIIai-DTT的變化則與APTT、PT變化相一致。由于在體外FV和FVIII的穩(wěn)定性差,易失活,要求APTT血漿標本必須在4h內(nèi)檢測。因此進行FXIIai-DTT也應(yīng)盡快在短時間內(nèi)完成。4種抗凝劑制備血漿所測得FXIIai-DTT均延長且明顯不同。枸櫞酸三鈉、草酸鈉和EDTA均是Ca2+的絡(luò)合劑,其中EDTA可與Ca2+形成一種不溶性復(fù)合物,具有強的Ca2+絡(luò)合能力。除此之外,EDTA還具有滅活FV的作用,因而血漿凝固時間較草酸鈉和枸櫞酸鈉要長。而草酸鈉結(jié)合Ca2+的能力較EDTA弱,但較枸櫞酸三鈉強,因此枸櫞酸鈉制備血漿的凝固時間最短。凝血酶是參與凝血后期反應(yīng)的關(guān)鍵酶,肝素通過與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合,可抑制凝血酶和絲氨酸蛋白酶(FXa、FIXa、FXIa)及血小板活化功能,而致血漿凝固時間明顯延長(本試驗為10min內(nèi)不凝固)。從4種抗凝劑所得的結(jié)果說明FXIIai-DTT可反映血漿中凝血抑制物的狀態(tài)。缺乏不同的凝血因子血漿FXIIai-DTT延長,也證明FXIIai-DTT是一種具有反映凝血因子含量或功能狀態(tài)的試驗方法。在乏FVIII血漿中,隨著其缺乏比例增高,APTT和FXIIai-DTT也相應(yīng)地延長。因此認為FXIIai-DTT與APTT一樣,也可作為檢測血友病的一種試驗方法應(yīng)用于臨床。在用硫酸鋇吸附血漿中FII、FVII、FIX和FX后,由于主要的外在和共同凝血途徑受到影響,因而FXIIai-DTT與PT均延長的相關(guān)性更為密切,FXIIai-DTT可反映出外凝血途徑受影響。在儲存血漿中,由于血漿貯存時間過長導(dǎo)致血漿中FV和FVIII的失活,FXIIai-DTT延長與APTT的相關(guān)性更大,因為貯存血漿缺乏內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子FVIII和共同途徑中的FV,說明FXIIai-DTT的變化也可反映內(nèi)在凝血途徑的變化。但需要強調(diào)的是,血漿中的凝血因子濃度或活性需要低到一定程度時,FXIIai-DTT才會與APTT和PT一樣出現(xiàn)變化。這是因為正常血漿凝固并非全部凝血因子參與,即正常生理情況下,血漿中的凝血因子有較多的貯備,因此在一定范圍內(nèi)隨著血漿的稀釋,某些檢測凝血因子的試驗會表現(xiàn)“正?！薄Ｓ嘘P(guān)抑肽酶和對羧基芐胺致FXIIai-DTT延長,而對PT和APTT無明顯影響的現(xiàn)象,其機理尚不清楚,可能與抑肽酶能競爭抑制FVIIa-TF復(fù)合物有關(guān)。但是纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)存