分子生物學(xué)實驗

分子生物學(xué)實驗1.幸免長時刻的培養(yǎng)，大腸桿菌同樣培養(yǎng)12個小時就能夠挑取克隆子進行驗證了。要緊是由于培養(yǎng)時刻過長，專門是含有Amp抗性的質(zhì)粒。重組菌能夠分泌酶降解Amp，造成平板中局部Amp濃度太低。其它未重組菌在Amp存在的情形下只是生長受克制而非死亡，當(dāng)Amp濃度減少時就能夠生長了。衛(wèi)星菌落，由于陽性菌落大量分解抗生素，造成周邊區(qū)域抗生素濃度減少，則無抗性的菌也生長出來了。一句話，你的板子培養(yǎng)時刻過長了。這是amp抗性質(zhì)粒特有的衛(wèi)星菌落，確實是又抗性的Ecol分泌beta內(nèi)酰胺酶分解周邊的amp，從而使沒有抗性的ecoli生長。2.3.乙醇能夠排除核酸的水化層，使帶負電荷的磷酸基團暴露出來。Na＋之類的平穩(wěn)離子能夠與這些帶電基團結(jié)合，在沉淀形成部位減少多核苷酸鏈之間的排斥作用。因此只有在陽離子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時才會發(fā)生乙醇沉淀。1.什么因素用無水乙醇沉淀DNA？用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最慣用的沉淀DNA的辦法。乙醇的優(yōu)點是能夠任意比和水相混溶，乙醇與核酸可不能起任何化學(xué)反映，對DNA專門安全，因此是抱負的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)固存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周邊的水分子，使DNA失水而易于聚合。同樣實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最后含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（由于無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。然而加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，專門用多次乙醇沉淀時，就會妨礙收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇替代無水乙酵，最后的沉淀環(huán)節(jié)要使用無水乙醇。也能夠用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。同樣在室溫下放置15－30分鐘即可。2.在用乙醇沉淀DNA時，什么因素一定要加NaAc或NaCl至最后濃度達0.1～0.25mol/L？在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，如此就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其成效也不行。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，妨礙DNA的酶切等反映，必須要進行洗滌或重沉淀。用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最慣用的沉淀DNA的辦法。乙醇的優(yōu)點是能夠任意比和水相混溶，乙醇與核酸可不能起任何化學(xué)反映，對DNA專門安全，因此是抱負的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)固存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周邊的水分子，使DNA失水而易于聚合。同樣實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最后含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（由于無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。然而加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，專門用多次乙醇沉淀時，就會妨礙收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇替代無水乙酵，最后的沉淀環(huán)節(jié)要使用無水乙醇。也能夠用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。同樣在室溫下放置15－30分鐘即可。1。DNA不溶于乙醇2。乙醇能夠吸附水分子（極性相似），使得溶液中相對的水分子減少，增大了DNA在水中的相對濃度。3。附：乙醇沉淀DNA需要鹽離子，用金屬離子屏蔽DNA上磷酸的負電荷，減少DNA分子間的斥力，才干沉淀完全。4.溶菌酶是一種堿性球蛋白，分子中堿性氨基酸、酰胺殘基和芳香族氨，酸的比例較高，酶的活動中心是天冬氨酸和谷氨酸。溶菌酶是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，稱包胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，它專一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4鍵，從而破壞細菌的細胞壁，使之松馳而失去對細胞的愛惜作用，最后使細菌溶解死亡。也能夠直截了當(dāng)破壞革蘭氏陽性菌的細胞壁，而達成殺菌的作用，這要緊是由于革蘭氏陽性細菌的細胞壁要緊是由胞壁質(zhì)和磷酸質(zhì)構(gòu)成，其中胞壁質(zhì)是由雜多糖和多肽構(gòu)成的糖蛋白，這種多糖正是由N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4鍵聯(lián)結(jié)的。對某些革蘭氏陰性菌，如埃希氏大腸桿菌，傷寒沙門氏菌，也會受到溶菌酶的破壞。溶菌酶是母乳中能愛惜嬰兒免遭病毒感染的一種有效成分，它能通過消化道而保持其活性狀態(tài)，溶菌酶還能夠使嬰兒腸道中大腸桿菌減少，增進雙歧桿菌的增加，還能夠增進蛋白質(zhì)的消化吸取5.酚、氯仿是變性蛋白質(zhì)的（由于苯酚能溶進少量水缺失DNA，因此與氯仿一起使用，減少DNA缺失）異戊醇是消泡劑（蛋白質(zhì)變性中經(jīng)常產(chǎn)動氣泡，會缺失DNA，因此需消泡）抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，如何樣使用酚與氯仿較好？酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。通過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保存在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大概10％～15％的水溶解在酚相中，因而缺失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚成效好，但氯仿與水不相混溶，可不能帶走DNA。因此在抽提過程中，混合使用酚與氯仿成效最佳。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，現(xiàn)在一起將酚帶走。也能夠在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。10．什么因素用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合平均，必須激烈振蕩容器多次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)動氣泡，氣泡會制止互相間的充足作用。加入異戊醇能減少分子表面張力，因此能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。同樣采納氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采納酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相堅持穩(wěn)固。1.酚/氯仿/異戊醇的作用：從核酸樣品中除去蛋白質(zhì)經(jīng)經(jīng)常使用酚和氯仿都能使蛋白質(zhì)變性，并使其溶于有機相或中間相內(nèi)，而異戊醇則有助于排除抽提過程中顯現(xiàn)的氣泡。6.β-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地避免酚氧化成醌,幸免褐變,使酚容易去除7.8.講得對。75%乙醇清洗DNA的目的是脫鹽的。其機理以下：75%乙醇中含有25%的水，這部分水能夠溶解和DNA沉淀中混有的、DNA沉淀前加入的鉀鹽（或鈉鹽），但同時也會溶解（缺失）少部分DNA（鹽離子比DNA更易溶于水中）。為了減少DNA缺失，因此用含量較高的乙醇溶液（DNA不溶于乙醇）。蛋白質(zhì)、糖、脂類等都能夠溶于75%酒精，而DNA不溶9.10.RNaseA的作用是使RNA降解，減少提獲得到的DNA中的RNA，方便減少對后續(xù)實驗的妨礙。RNaseH是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。消化mRNA用的。RNaseH，即RibonucleaseH，中文名為核糖核酸酶H，是一種核糖核酸內(nèi)切酶，能夠特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA。RNaseH不能水解單鏈或雙鏈DNA或RNA中的磷酸二酯鍵，即不能消化單鏈或雙鏈DNA或RNA。特點：特異性消化DNA-RNA雜合鏈中的RNA，慣用于cDNA第二鏈的合成編輯本段用途·在cDNA第二鏈合成前往除mRNA·DNA-RNA雜交體的鑒定·在Oligo(dT)存在下去除mRNA的poly(A)尾11.當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠快速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。破細胞的要緊是堿，而不是SDS，因此才叫堿法抽提。0.2NNaOH：是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌仍舊哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬時就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）構(gòu)造向micelle（微囊）構(gòu)造的相變化所造成。由于質(zhì)粒和細菌染色體的拓撲構(gòu)造不同，變性時前者盡管兩條鏈分離，卻仍舊纏繞在一起不分開；但后者完全變性分甚至顯現(xiàn)斷裂。因此，在裂解細菌時要注意：第一，時刻不能過長，由于在如此的堿性條件下DNA片斷會慢慢斷裂；第二，混合必須輕柔，否則DNA也會斷裂。1%SDS（十二烷基磺酸鈉）：是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使某些蛋白質(zhì)變性。12.這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一種SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時基因組DNA也被PDS共沉淀。當(dāng)加入pH4.8的酸性乙酸鉀減少溶液pH值，使溶液pH值復(fù)原較低的近中性水日常，質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可快速復(fù)性復(fù)原雙鏈構(gòu)造，然而主染色體DNA則難以復(fù)性。SDS碰到鉀離子后變成十二烷基硫酸鉀（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶于水的，而高濃度的鹽使得沉淀更完全。SDS極易和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一種SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了。同時，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合，由于大腸桿菌的基因組DNA專門長，專門容易和變性的蛋白質(zhì)纏繞在一起。在離心時，大部分主染色體與細胞碎片，變性蛋白質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA以可溶性狀態(tài)留在上清夜中。13.所謂星活性又稱Star活性。是指由于反映條件不同而產(chǎn)生的切斷與原先認識序列不同的位點的現(xiàn)象，也確實是講產(chǎn)生Star活性后，不僅能夠切斷特異性的識別位點，還能夠切斷非特異性的位點。產(chǎn)生Star活性的成果是酶切條帶增多。因此講Star活性與粘端變平端沒關(guān)系。另外，Star活性除了與酶本身的性質(zhì)有關(guān)外，與甘油濃度，pH值及離子濃度有關(guān)。同樣正規(guī)廠家生產(chǎn)的限制酶出廠前都做有關(guān)的檢測，buffer體系也都做了對應(yīng)的考慮。因此正常情形下酶切，能夠先不必考慮Star活性的咨詢題。一旦顯現(xiàn)底物DNA不行切斷，需要增加酶量或延長反映時刻時，如果使用的是易產(chǎn)生StaR活性的限制酶切，同樣優(yōu)先考慮增加酶量，而不是延長反映時刻，換句話講，延長時刻比增加酶量更易產(chǎn)生Star活性。另外，事實上幾乎全部的限制性內(nèi)切酶都可能產(chǎn)生Star活性。但現(xiàn)在Star活性對實際實驗室操作過程中的妨礙并不太大，能夠先不考慮。同樣來講，限制性內(nèi)切存在嚴格的識別在序列特異性，但某些條件變化，會使其對識別序列特異性的放寬，而造成在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割，限制性內(nèi)切酶體現(xiàn)的這種活性稱為星活性，或第二活性，在名稱右上角加一星號表達。產(chǎn)生星活性的條件①甘油濃度②離子強度高鹽緩沖液酶減少鹽③pH值7.5～8．5產(chǎn)生④有機溶劑DMSO(二甲亞砜)1～2%(V/V)⑤二價陽離子Mn2+替代Mg2+⑥酶與DNA的比例酶與DNA比為(50U／μg)產(chǎn)生星活性。為了避免星活性的顯現(xiàn)，全部限制性內(nèi)切酶反映在原則條件下(專門是pH、離子強度、二價離子濃度的條件下)進行。某些限制性內(nèi)叨酶誘導(dǎo)產(chǎn)生星活性的反映條件酶誘導(dǎo)星活性條件AvaIA,B,DEcoRIA,B,D,E,FHaeⅢB,DHhaIB,D,GBamHIA,B,C,D,E,HA．乙二醇(45％)；B.甘油(11～20％)；C.乙醇(12％)；D．高酶：DNA比值()25U／μg)；E．Mn2+替代Mg2+；F．pH8．5；G．DMSO(8％)；H．無NaCl14.同時雙酶切是一種省時省力的慣用辦法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是專門重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供對應(yīng)的最佳NEBuffer，以確保100%的酶活性。NEBuffer的構(gòu)成及內(nèi)切酶在不同緩沖液中的活性見《內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的講明書。能在最大程度上確保兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液條件下的切割速率會減緩，因此使用時可按照每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性對應(yīng)調(diào)節(jié)酶量和反映時刻。要確保雙酶切實驗的高效、精確，就要選擇適宜的通用buffer。如此就能幸免質(zhì)粒和基因沒有切動或者被切散。慣用的幾家內(nèi)切酶公司有MBI、NEB、Promega、Roche、Takara，要查找雙酶切體系的通用buffer，最佳到出品該內(nèi)切酶的公司網(wǎng)站上查詢。15.緩沖液在電泳過程中的一種作用是堅持適宜的pH。電泳時正極與負極都會發(fā)生電解反映，正極發(fā)生的是氧化反映（4OH--4e->2H2O+O2)，負極發(fā)生的是還原反映（4H++4e->2H2)，長時刻的電泳將使正極變酸，負極變堿。一種好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強的緩沖能力，是溶液兩極的pH保持差不多不變。電泳緩沖液的另一種作用是使溶液含有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移，例如，同樣電泳緩沖液中應(yīng)含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化。電泳緩沖液尚有一種組分是EDTA，加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+等離子，避免電泳時激活DNA酶，另外還可避免Mg2+離子與核酸生成沉淀。16.17.有關(guān)瓊脂糖凝膠電泳，濃度普通在0.5～2％之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易辨論，造成條帶缺失現(xiàn)象?？讖酱蟮沫傊?。19.⑴、細胞的生長狀態(tài)和密度最佳從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直截了當(dāng)轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。不要用差不多過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600操縱。對TG1菌株，OD600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應(yīng)注意OD600值與細胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或局限性均會使轉(zhuǎn)化率下降。另外，受體細胞同樣應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺點的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。同時受體細胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。⑵、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)要緊是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范疇內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。同樣地，DNA溶液的體積不應(yīng)超出感受態(tài)細胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達成飽和。有關(guān)以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明，不不大于30kb的重組質(zhì)粒將專門難進行轉(zhuǎn)化。另外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也緊密有關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相似的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。⑶、試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純潔的水配制，最佳分裝儲存于4℃。⑷、避免雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最佳是新的，并經(jīng)高壓滅菌解決。全部的試劑都要滅菌，且注意避免被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會妨礙轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。⑸、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉(zhuǎn)化率將會減少。20.TAE是Tris-乙酸，緩沖容量小，然而溶解度大，易于儲存TBE是Tris-硼酸，緩沖容量大，然而溶解度小，不易長久儲存，易產(chǎn)生沉淀TAE與TBE的區(qū)別第一要明白TAE與TBE緩衝溶液的成分以下：50xTAEBuffer(Tris-Acetate-EDTA)242gmTrisbase57.1mlAceticacid100ml0.5MEDTAAddddH2Oto1literandadjustpHto8.5.10xTBEBuffer(Tris-Borate-EDTA)108gmTrisbase55gmBoricacid9.3gmNa4EDTAAddddH2Oto1liter.ThepHis8.3andrequiresnoadjustment.它們的分別有下列幾點：1.TBE不能太濃(它只可有10times)，因為borate會專門容易沉澱，但同樣有少許沉澱是不會有太大問題。2.TBE的bufferingcapacity比TAE高，用TBE來跑出來的gel，辨論率(resolution)會比較高。3.因為TBE有borate離子(ion)，它會影嚮酵素(enzyme)的工作。因此，若要為分離出的DNA進行下一步酵素處理，如cloning或restrictioncut的話，就要切記不要讓DNA碰上borateion。4.TAE的buffercapacity比較差，gel同樣比較含糊，但它不會對影嚮酵素三種緩沖液的配制辦法Tris-乙酸（TAE）：50×濃貯存液（每升）：242gTris堿57.1ml冰乙酸100ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)使用時再稀釋50倍。Tris-磷酸（TPE）：10×濃貯存液（每升）：108gTris堿15.5ml85％磷酸（1.679g/ml）40ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)使用時再稀釋10倍。Tris-硼酸（TBE）：5×濃貯存液（每升）：54gTris堿27.5g硼酸20ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)21.原則的PCR反映體系：10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L800ul引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反映五要素：參加PCR反映的物質(zhì)要緊有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+22.1、考慮與否引物有咨詢題，不特異；2、與否Taq酶加多了，同樣50ul體系加1UTaq就能夠了；3、與否是Mg2＋加多了，Mg2＋加多了會造成非特異擴增；4、與否退火溫度不行？5、與否循環(huán)數(shù)過多，PCR擴增后期，進入平臺期擴增，錯誤擴增增加，非特異性也增強.23.可能有以下緣故:1,模板量過低;2,引物濃度多大;3,退火時刻過長.4,最重要的一點是,在引物設(shè)計過程中幸免引物間有互補序列,專門是3'末端,同時盡量使引物3'末端的GC含量高一點,使與模板緊密結(jié)合.做到以上各點,同樣可不能顯現(xiàn)引物二聚體了.24.由于RNase能快速降解RNA，且耐熱、耐酸、耐堿，不需要輔助因子，用蛋白質(zhì)變性劑只能使之臨時失活，變性劑去除后，其活性又可復(fù)原。因此，分離提取RNA時，為確保RNA的完整性，必須制造一種無RNase的環(huán)境，操作時應(yīng)專門注意下列幾個方面：1．操作者在整個實驗過程中必須戴消毒手套和口罩，并經(jīng)常更換。2．玻璃器皿沖洗干凈后，需180~250℃干烤4小時以上。3．盡量使用一次性塑料制品(Ep管、吸頭等)，用0.1%DEPC溶液浸泡過夜，80℃烤干后高壓滅菌。4．電泳槽沖洗干凈后，于3%H2O2中浸泡30分鐘以上，然后用0.1%DEPC溶液或高壓滅菌水完全沖洗。5．除Tris類試劑外，全部溶液用0.1%DEPC解決12小時以上，然后高壓消毒。所用試劑應(yīng)未開封或RNA專用試劑。6．使用強烈、有效的RNase克制劑以克制內(nèi)源RNase。慣用的RNase克制劑有異硫氰酸胍（GTC）、氧釩核糖核苷復(fù)合物（VRC）、RNasin及焦碳酸二乙酯（DEPC）等。評判RNA質(zhì)量的原則是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取決于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)；完整的RNA則取決于最大程度地幸免純化過程中內(nèi)源性及外源性RNase對RNA的降解。普通采納紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，純RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的標本不同，此比值有一定的變化，同樣在1.7~2.0之間，低于該值表明有蛋白污染，需進一步用酚/氯仿抽提。有時樣本的A260/A280可能不不大于2.0，如重復(fù)讀數(shù)無誤，并不表達純度有咨詢題。RNA的完整性可通過瓊脂糖電泳法進行鑒定。完整的RNA電泳時，28S（約4.8Kb）和18S（約1.9Kb）rRNA經(jīng)EB染色后，兩條電泳條帶的顯色強度近似為2比1。25.RNA提取提取RNA能夠分為總RNA，mRNA，VirusRNA（RNA病毒）幾類Trizol即異硫氰酸胍-苯酚法，這種辦法的原理是：第一用強變性劑異硫氰酸胍裂解細胞，同時使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，開釋出核酸。開釋出來的DNA和RNA由于在特定pH時溶解度不同，分別位于整個體系中的中間相和水相，從而使DNA和RNA分離開來。進一步通過有機溶劑來抽提沉淀RNA，就能夠得到純潔的RNA；26.27.一、避免RNA酶污染的方法1.全部的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時刻。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應(yīng)盡量的用0.1%DEPC，在37℃解決12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC解決過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.設(shè)立RNA操作專用實驗室，全部器械等應(yīng)為專用。二、慣用的RNA酶克制劑1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不完全的RNA酶克制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而克制酶的活性。2.異硫氰酸胍：現(xiàn)在被認為是最有效的RNA酶克制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞構(gòu)造使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全克制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白克制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提獲得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性克制劑，能夠和多個RNA酶結(jié)合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定克制作用。28.29。配1000ml的DEPC解決水，加1mlDEPC。磁力攪拌器攪拌過夜。翌日高壓蒸汽滅菌121c，25minDEPC分解成二氧化碳和酒精，封閉冷藏備用。最佳分裝小瓶來用，盡量幸免污染。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)解決過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。經(jīng)檢測不含RNase、DNase和proteinase。DEPC水能夠用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的多個反映體系如反轉(zhuǎn)錄、siRNA的退火等，以及其它多個規(guī)定無RNase、DNase和proteinase的反映體系。DEPC水同樣是指千分之一濃度的DEPC,在攪拌器上攪拌至完全溶解，即看不到“油珠”為止，用來解決槍頭、EP管的DEPC水不需高壓滅活，而用于配制DEPC酒精等試劑和用來這種RNA有關(guān)實驗的DEPC水需滅火后使用。DEPC氣味芳香濃烈，強揮發(fā)性，有毒，需在通風(fēng)櫥中操作。辦法是：取市售DEPC1ml，加入1L待解決水（蒸餾水等）中，經(jīng)激烈振搖后，于室溫靜止數(shù)小時，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO2和乙醇）。有些試劑可直截了當(dāng)加入DEPC，終濃度同樣為0.1%～0.4%，原則上在雜交及其往常的環(huán)節(jié)中，全部液體試劑均需用DEPC解決，或用DEPC水配制，涉及乙醇的稀釋。另外，接觸標本以及標本有關(guān)的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。注意：①DEPC是潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，并幸免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。去離子純潔水加入DEPC達濃度0.1%，室溫下持續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后濕熱高壓滅菌完全揮發(fā)去除DEPC后能夠長久儲存在室溫或4度冰箱，不適宜重復(fù)使用。30.31.非變性凝膠里面沒加變性劑，同樣是SDS。非變性膠跑出來的蛋白能保持其活性同樣用做功效實驗，如EMSA。由于沒有變性劑的緣故非變性膠電泳時除了與蛋白分子量有關(guān)也會受都電荷的妨礙，因此對蛋白等電點的擬定和緩沖液的酸堿性有注意，有時需要倒轉(zhuǎn)電泳時的正負極。從跑的膠來看，變性膠會比較好看，帶比較窄，非變性膠跑出來則比較粗糙。32.[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。[2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。[3]使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲酰胺10ml。[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。[5]加2ml5×載樣緩沖液。[6]上樣、同時加RNA標記物（同位素（32P）dCTP）。[7]60伏電泳過夜。[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。[9]室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉(zhuǎn)印。[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使膠中和。[11]20×SSC洗膠1h。[12]20×SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。<3>注意事項[1]嚴格恪守實驗規(guī)則，物必精確。[2]由于好多藥品是有毒的，對人體有害，請注意本身安全，做好防護。33.要進行北方雜合反映前，必須先將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至硝化纖維紙（nitrocellulosemembrane）或尼龍膜（nylonmembrane）上，這一種過程稱為轉(zhuǎn)?。╞lotting）。同樣慣用的辦法涉及毛細管轉(zhuǎn)移法（capillarytransfer）、真空轉(zhuǎn)移法（vacuumtransfer）與電轉(zhuǎn)印法（electroblotting）。毛細管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸取轉(zhuǎn)移緩沖液時所產(chǎn)生的牽引力量將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至膜上；要轉(zhuǎn)印完全，起碼需要作用6h以上。盡管所需耗費的時刻比較長，以其不須要專門的儀器設(shè)備，毛細管轉(zhuǎn)移法現(xiàn)在仍被普遍采納。若分析RNA時采納變性聚丙烯酰胺膠體電泳，則必須以電轉(zhuǎn)印法進行RNA轉(zhuǎn)印。至于膜的選擇，硝基纖維素膜的優(yōu)點是比較可不能產(chǎn)生非專一性反映；只是其一旦被潤濕再烘