微衛(wèi)星與單核苷酸多態(tài)性在動(dòng)物遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用

微衛(wèi)星與單核苷酸多態(tài)性在動(dòng)物遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用

在藥物和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，中心交系和遠(yuǎn)交系（封閉組）小鼠作為重要的動(dòng)物模型發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳穩(wěn)定性,會(huì)隨著偶然的錯(cuò)配或遺傳漂變使其發(fā)生遺傳背景的改變,從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性與可靠性。定期對(duì)實(shí)驗(yàn)用大小鼠進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)是保證其遺傳質(zhì)量必不可少的措施。傳統(tǒng)遺傳檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和生物化學(xué)等方法,但這些方法有其局限性,且不能有效地檢測(cè)出各個(gè)亞系之間的遺傳差異。隨著一系列分子遺傳標(biāo)記的發(fā)現(xiàn),分子生物學(xué)檢測(cè)方法被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè),可直接檢驗(yàn)動(dòng)物核酸序列的改變,為近交系動(dòng)物的遺傳檢測(cè)提供了直接客觀的途徑。當(dāng)前,檢測(cè)DNA多態(tài)性方法主要有DNA指紋技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、PCR單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)[9—11]和微衛(wèi)星(Microsatellite)[12—22]等。其中微衛(wèi)星和SNP已經(jīng)大量應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳檢測(cè)。微衛(wèi)星DNA是由2—6bp堿基組成的一個(gè)多次串聯(lián)重復(fù)序列,又稱為短序列重復(fù)(Shorttandemrepeat,STR)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Singlesequencerepeats,SSR),普遍存在于真核生物的基因組中,平均每10kb就出現(xiàn)一個(gè)STR。通過(guò)其可以對(duì)多態(tài)信息含量(PIC)、群體雜合度分析、遺傳距離分析等進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定,已廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)分析、基因圖譜分析及親緣關(guān)系等研究。SNP是繼RAPD和微衛(wèi)星標(biāo)記之后的第三代遺傳標(biāo)記。SNP是指在基因組DNA中某個(gè)特定核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。通常認(rèn)為SNP是有兩種類型,即雙等位基因。SNP是基因組中最豐富的DNA序列變化形式,是最常見(jiàn)的可遺傳變異。1星和sph的特點(diǎn)1.1微衛(wèi)星監(jiān)測(cè)技術(shù)的遺傳穩(wěn)定性微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物基因組中,微衛(wèi)星DNA序列具有以下特點(diǎn):1)保守性:微衛(wèi)星位點(diǎn)在種內(nèi)是高度保守的,在近似種間也有一定的保守性,即在一些緊密相關(guān)的物種中其重復(fù)單位和重復(fù)次數(shù)具有一定相似性;2)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因符合孟德?tīng)栠z傳定律;3)多態(tài)性:在正常動(dòng)物群體中微衛(wèi)星拷貝數(shù)在某一群體中是可變的;4)具有遺傳連鎖不平衡現(xiàn)象;5)有些位于編碼區(qū)可被轉(zhuǎn)錄,而另一些分布于非編碼區(qū)而在不同基因位點(diǎn)上的微衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列可以不同,也可相同。1.2symp的特點(diǎn)2星和sph遺傳檢測(cè)方法2.1檢測(cè)手段多樣化科學(xué)合理的利用微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳學(xué)特點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定和檢測(cè)是其應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,對(duì)微衛(wèi)星DNA的檢測(cè)手段也更加多樣化,進(jìn)而使其檢測(cè)的成本降低、靈敏度升高、檢測(cè)程序的標(biāo)準(zhǔn)化程度提高。目前有以下幾種主要的檢測(cè)方法。2.2實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)自從SNP被提出之后,研究者對(duì)篩查SNP的方法進(jìn)行了不斷的探索和改進(jìn),已建立的SNP分析方法很多,包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP),直接測(cè)序,高效液相色譜(DHPLC),等位基因特異性PCR(AS-PCR)、基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-TOFMS)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP)、基于高溫連接酶的連接檢測(cè)反應(yīng)(ligasedetectionreaction,LDR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)。對(duì)其中最為主要的幾種方法簡(jiǎn)要概述。2.2.1ss-pcr檢測(cè)dna分子中的化合物基于PCR技術(shù)的以構(gòu)象為基礎(chǔ)的檢測(cè)基因組中SNP的方法,用內(nèi)切酶降解DNA樣品后做變性處理,非變性條件下,電泳,單鏈DNA鏈內(nèi)堿基互作發(fā)生卷曲而形成一個(gè)較為穩(wěn)定的空間構(gòu)象,DNA序列的改變會(huì)使卷曲的DNA分子構(gòu)象發(fā)生改變,所以,有序列差異的DNA分子通過(guò)非變性凝膠時(shí),由于構(gòu)象的不同,所受到的阻力大小也就不同,結(jié)果是涌動(dòng)的速度不同,此方法結(jié)合了毛細(xì)管電泳,可以顯著的提高通量,最后經(jīng)條件優(yōu)化,提高了分辨率。2.2.2as-pcr2.2.3堿基檢測(cè)snps法測(cè)定堿基因子可精確檢測(cè)產(chǎn)物到達(dá)監(jiān)視器的飛行時(shí)間與其質(zhì)量相關(guān)關(guān)系,可與許多其他方法結(jié)合檢測(cè)SNPs,如同小序列結(jié)合精確鑒別4種堿基間質(zhì)量差異,為SNP檢測(cè)提供了新工具。2.2.4pcr-ldr該平臺(tái)的建立基于近交系小鼠SNP快速分型方法,用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的遺傳質(zhì)量與品系純度。2.2.5基于snp的snp測(cè)定法通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物的熒光信號(hào)進(jìn)行追蹤,達(dá)到對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析的目的,基于該法擴(kuò)增反應(yīng)的SNP測(cè)定法具有特異性高、成本低、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn),適合進(jìn)行大規(guī)模DNA樣品的SNP檢測(cè)工作。3大鼠微衛(wèi)星和sph遺傳檢測(cè)3.1小鼠遺傳檢測(cè)微衛(wèi)星具有基因位點(diǎn)多、多態(tài)性高、擴(kuò)增片段短等突出特點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)小鼠品系的鑒定中實(shí)驗(yàn)價(jià)值較高。近交系和封閉群小鼠中微衛(wèi)星長(zhǎng)度變化有很低的發(fā)生率,因此,微衛(wèi)星的長(zhǎng)度可以作為某一品系小鼠恒定的參數(shù),而在不同近交系小鼠之間微衛(wèi)星的長(zhǎng)度有所差異,所以近交系小鼠的遺傳檢測(cè)可通過(guò)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。Teppner等用153個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)C57BL/6、CFW和ICR的遺傳背景小鼠進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)ICR和CFW與C57BL/6不同分別有76和70個(gè)位點(diǎn);王洪等用20對(duì)引物對(duì)12個(gè)品系(BALB/C、C57BL/6、DBA、C57BL/9、C57BL/10、TAI、TA2、T739、M615、SCID、NIH和KM)的小鼠進(jìn)行STR擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:STR技術(shù),可用于對(duì)這些品系小鼠的遺傳檢測(cè)。謝建云等利用22個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)2個(gè)飼養(yǎng)單位的近交系BALB/C小鼠和封閉群ICR小鼠的遺傳特征進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)STR不僅可以檢測(cè)近交系的遺傳質(zhì)量,還可以分析封閉群的遺傳多態(tài)性。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記方法在近交系小鼠遺傳分析中的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究,并篩選出一些有鑒別意義的微衛(wèi)星位點(diǎn)。研究表明,微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同品系以及亞系的小鼠之間具有多態(tài)性,可采用微衛(wèi)星標(biāo)記方法區(qū)分不同的近交小鼠品系及其亞系。到目前為止在小鼠的基因組內(nèi)共發(fā)現(xiàn)7300多個(gè)STR位點(diǎn),其中90%以上具有豐富多態(tài)性,以此檢測(cè)近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)質(zhì)量的報(bào)道很多,并且證明該方法的可靠性優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的生化標(biāo)記法,被視為最佳的分子檢測(cè)手段[20、22]。3.2基于微衛(wèi)星和ssr的遺傳檢測(cè)大鼠作為重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,在生理學(xué)、藥理學(xué)和與人相關(guān)的復(fù)雜疾病的研究中發(fā)揮重要作用。李瑞生等選取大鼠7條染色體上的微衛(wèi)星位點(diǎn)合成了10對(duì)引物,利用PCR技術(shù)對(duì)6個(gè)品系(SHR、SHRSP、LEW、RCS、WKY和F344)的8個(gè)近交系大鼠群體進(jìn)行了DNA微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的分析,同樣發(fā)現(xiàn),大鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有顯著多態(tài)性:不同品系個(gè)體之間以及不同地區(qū)同一品系的不同個(gè)體之間均存在一定的差異。該方法為近交系大鼠的遺傳背景檢測(cè)提供了可靠的信息。Elizabeth建立起大鼠微衛(wèi)星遺傳圖譜,選取了87個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,覆蓋20對(duì)常染色體,對(duì)6種近交系大鼠進(jìn)行遺傳檢測(cè),確認(rèn)40個(gè)遺傳信息豐富的微衛(wèi)星位點(diǎn)。Mashimo等對(duì)122個(gè)大鼠品系的基因組進(jìn)行簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)標(biāo)記,報(bào)告357個(gè)SSLP標(biāo)記,在20號(hào)染色體上有10個(gè)SSLP位點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,大鼠的基因組草圖已公布,完整的大鼠主要組織相容性復(fù)合體(RT1)核苷酸序列將為大鼠主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的結(jié)構(gòu)和序列分析、多態(tài)性研究及單倍體圖譜的繪制提供了大量的物質(zhì)資料。主要組織相容性復(fù)合體(RT1)是決定近交系大鼠免疫遺傳品質(zhì)最主要的基因群,也是進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域,Takagi等在大鼠主要組織相容性復(fù)合體(RT1)區(qū)新發(fā)現(xiàn)57個(gè)SSLP,與已存在的10個(gè)SSLPs共67個(gè)SSLPs,對(duì)67個(gè)不同近交系大鼠通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行了基因分型和遺傳圖譜的繪制。對(duì)RT1復(fù)合體的基因序列的完善及其相關(guān)功能的深入研究,將有利于使大鼠成為成熟實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。3.3snp位點(diǎn)分析近年來(lái),SNP技術(shù)被用于近交系小鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè),并建立了近交系小鼠的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)。美國(guó)JAX實(shí)驗(yàn)室的Petkov等對(duì)小鼠的235個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選,獲取28個(gè)信息豐富的SNP位點(diǎn),這些標(biāo)記覆蓋了所有小鼠常染色體和X染色體,足以鑒別48個(gè)近交系小鼠。表明該方法是一個(gè)快速、可靠及高效的遺傳檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi),胡培麗等[10、11]采用等位基因?qū)Ｒ恍詳U(kuò)增,16個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)5種近交系小鼠進(jìn)行遺傳檢測(cè),從基因組水平的單個(gè)核苷酸差異來(lái)鑒別近交系小鼠遺傳質(zhì)量,發(fā)現(xiàn)本方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出小鼠基因組中的SNP,通過(guò)多個(gè)SNP位點(diǎn)綜合分析,可以有效地鑒別已有的近交系小鼠。SNP標(biāo)記的發(fā)展極大提高了鑒別近交系小鼠遺傳背景的能力。3.4snps標(biāo)記構(gòu)建及應(yīng)用Guichoux等通過(guò)全基因組鳥(niǎo)槍法片段(Wholegenomicshotgun,WGS)和表達(dá)序列標(biāo)簽(Exprssedsequencetags,ESTs)對(duì)已識(shí)別的高密度33305個(gè)候選SNPs進(jìn)行證實(shí),結(jié)果表明,66%的SNPs是在不同大鼠品系中通用的,并新發(fā)現(xiàn)287個(gè)新的SNPs。Saar等運(yùn)用3×106個(gè)不同SNPs對(duì)167種近交系、2種重組近交系和F2互交系大鼠進(jìn)行基因型分析,共產(chǎn)生20238個(gè)有效的SNPs,同時(shí)構(gòu)建了SNPs標(biāo)記遺傳圖譜,闡述了連鎖不平衡的程度。劉軍須等應(yīng)用近交系大鼠生化標(biāo)記和分子生物學(xué)標(biāo)記對(duì)MIJ和HFJ大鼠進(jìn)行研究,顯示11個(gè)生化位點(diǎn)完全純合,且兩個(gè)品系大鼠生化遺傳概貌完全一致,再對(duì)兩個(gè)品系的大鼠進(jìn)行了SNP分析研究,確定了MIJ和HFJ大鼠在9個(gè)位點(diǎn)的基因型。將由單個(gè)核苷酸之間的差異而引起的遺傳多樣性DNA片段,用于檢測(cè)基因組單個(gè)核苷酸的改變,為進(jìn)一步完善品系等位基因信息,開(kāi)發(fā)和利用新型動(dòng)物品系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。SNP是基因組中最豐富的DNA序列的變化形式,是最常見(jiàn)的可遺傳變異。許多由于選擇壓力或者遺傳漂變而發(fā)生的潛在變異只有通過(guò)SNP分析能被檢測(cè)出來(lái)。SNP標(biāo)記將在大鼠遺傳控制檢測(cè)中成為理想的遺傳標(biāo)記。3.5采用snp庫(kù)檢測(cè)小鼠遺傳質(zhì)量2002年,國(guó)際小鼠基因組測(cè)序聯(lián)盟完成了經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室品系C57BL/6J(B6)的全測(cè)序。同年,Celera公司也完成了另外三個(gè)近交系的全序列草圖。由于SNP與微衛(wèi)星數(shù)量龐大,高通量的基因分型能降低成本,故著名的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司都已使用該遺傳標(biāo)記進(jìn)行遺傳檢測(cè)[52—54]。對(duì)于遺傳質(zhì)量檢測(cè)并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),其位點(diǎn)組合和數(shù)量是根據(jù)需要和各公司的實(shí)際情況決定的。國(guó)際上比較知名的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商,如TheJacksonLaboratory(JAX),CharlesRiver,Taconic和Harlan等,均提出了各自的遺傳監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。如TheJacksonLaboratory提供2000個(gè)SNP評(píng)估芯片(/genome/snp.html),采用27個(gè)位點(diǎn)的SNP庫(kù)對(duì)小鼠進(jìn)行遺傳檢測(cè)然而近交系動(dòng)物并不是100%等位基因一致,再加上嚙齒類擁有上萬(wàn)種微衛(wèi)星位點(diǎn)和上百萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn),現(xiàn)在遺傳檢測(cè)的數(shù)量和覆蓋率是很低的,并不能有效的檢測(cè)到遺傳漂變。但這兩類檢測(cè)方法對(duì)于因錯(cuò)配引起的遺傳污染非常有效,甚至可以分析出引起污染的小鼠品系。因此,這些知名的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商均采用了類似的綜合方法進(jìn)行遺傳質(zhì)量控制,具體內(nèi)容簡(jiǎn)述如下。首先,利用毛色等表型特性,避免將毛色一致的品系飼養(yǎng)在同一個(gè)房間內(nèi);將逃逸的動(dòng)物安樂(lè)死等。在品系管理方面,分為核心群,擴(kuò)大群和生產(chǎn)群進(jìn)行分類管理。核心群要求飼養(yǎng)在隔離器中,嚴(yán)格按照全同胞交配(full-sibmating),有明確的譜系(pedigreed)記錄。擴(kuò)大群仍按照全同胞交配,不要求譜系記錄。生產(chǎn)群采用隨機(jī)交配,一般3—5年后,重新從擴(kuò)大群或核心群引種。對(duì)于遺傳漂變的控制,主要通過(guò)延緩世代間隔的方法。如JAX采用凍存核心群胚胎的方式,一次凍存的胚胎可供10—25年使用,每5代后復(fù)蘇胚胎回復(fù)為原來(lái)的核心群,這樣相當(dāng)于10—25年可使用1個(gè)世代間隔的小鼠。采用這種方式,100年該品系僅歷經(jīng)4—10個(gè)世代間隔,而常規(guī)的擴(kuò)繁方法要?dú)v經(jīng)約300個(gè)世代間隔(/jaxnotes/archive/498.pdf)?？梢?jiàn),對(duì)于遺傳質(zhì)量檢測(cè)并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),其位點(diǎn)組合和數(shù)量是根據(jù)檢測(cè)具體的需要和各公司的實(shí)際情況決定的。4snp檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)傳統(tǒng)的遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法(皮膚移植法、生化標(biāo)記基因檢測(cè)、毛色基因檢測(cè)等)主要通過(guò)遺傳基因表型特征的變化來(lái)推測(cè)相應(yīng)的基因變化,但存在精確度不高,檢測(cè)位點(diǎn)及反映遺傳概貌有限等局限,不能準(zhǔn)確地檢測(cè)出各個(gè)品系之間遺傳的差異。微衛(wèi)星作為第二代遺傳檢測(cè)技術(shù),具有高度的多態(tài)性和豐富的可供個(gè)體識(shí)別的標(biāo)志位點(diǎn),能夠反映出動(dòng)物的遺傳變異情況且操作簡(jiǎn)單,只需剪小段尾巴提取DNA進(jìn)行檢測(cè),而不必處死大、小鼠,且實(shí)驗(yàn)不依賴于昂貴的儀器,因此應(yīng)用廣泛。然而,目前我國(guó)微衛(wèi)星在大、小鼠中的研究,僅局限于不同的實(shí)驗(yàn)室各自選用不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)近交系大、小鼠多態(tài)性進(jìn)行的分析,由于所選的微衛(wèi)星位點(diǎn)不盡相同,缺乏系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)。SNP作為第三代遺傳檢測(cè)技術(shù),具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn):1)相對(duì)于生化法和免疫學(xué)方法能夠鑒別那些本身很難鑒別的一些同基因型和同源品系;2)SNP檢測(cè)方法比生化法方便的重要優(yōu)點(diǎn)是不需處死動(dòng)物,所有基因純度在其生產(chǎn)下一代之前就得到了保證;3)SNP檢測(cè)法可達(dá)到高通量、低成本及自動(dòng)化,能夠滿足大規(guī)模的檢測(cè)需求。由于SNP數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)目巨大,分析依賴的設(shè)備和引物探針成本高,國(guó)外主要用于常見(jiàn)的小鼠品系遺傳檢測(cè),大鼠品系的應(yīng)用還處于研發(fā)階段。國(guó)內(nèi)小鼠的SNP遺傳檢測(cè)技術(shù)還沒(méi)有普及應(yīng)用?？傊?微衛(wèi)星和SNP遺傳檢測(cè)技術(shù)目前已成為國(guó)際上大、小鼠遺傳檢測(cè)的主流技術(shù),二者均有其優(yōu)勢(shì)和不足,可以滿足不同的檢測(cè)需要。在國(guó)外,大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商已經(jīng)建立了各自的遺傳檢測(cè)體系,這些位點(diǎn)庫(kù)(如幾個(gè)到幾百個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星庫(kù);幾十個(gè)到幾千個(gè)位點(diǎn)的SNP庫(kù))或者用于常規(guī)的遺傳檢測(cè),或者用于分析某一特定小鼠的遺傳特征,這些信息均在其網(wǎng)站公布。在國(guó)內(nèi),微衛(wèi)星和SNP遺傳檢測(cè)技術(shù)的研究起步較晚,但進(jìn)展迅速。相信微衛(wèi)星和SNP遺傳檢測(cè)技術(shù)會(huì)很快趕超國(guó)際先進(jìn)水平。1.2.1SNP數(shù)量多、分布廣、密度高:目前為止SNP是分布最廣、數(shù)量最多的一種遺傳多態(tài)性。在人類基因組中平均每100—300bp堿基中就有一個(gè)SNP,微衛(wèi)星則在每2—30kb中有一個(gè),有人認(rèn)為SNP在整個(gè)基因組的分布達(dá)3×106個(gè)。1.2.2富有代表性:某些SNPs能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或者表達(dá)水平