nf-基因及內(nèi)側(cè)dbr熒光定量pcr質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

nf-基因及內(nèi)側(cè)dbr熒光定量pcr質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇一直是臨床醫(yī)學(xué)研究的中心問題。通過選擇與人體結(jié)構(gòu)、功能、代謝和疾病特征相似的動(dòng)物，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因小型豬在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨骼發(fā)育、礦物質(zhì)代謝、皮膚等方面與人極其相似,生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用4～6月齡,體重約10～20kg的微型豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。版納微型豬近交系是云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾養(yǎng)志教授帶領(lǐng)課題組利用全同胞和親子交的高度近交方式加嚴(yán)格選擇培育成功的大型哺乳動(dòng)物近交系,具有遺傳背景清楚、基因純合度和一致性高等優(yōu)點(diǎn),它將為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究、異種器官移植及動(dòng)物模型的建立等方面提供純系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,可發(fā)揮抵抗細(xì)菌或寄生蟲感染、病毒的復(fù)制、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控及免疫調(diào)節(jié)作用,是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子,它具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用,對(duì)腫瘤的免疫治療具有一定的療效。TNF-α是與臨床多種疾病密切相關(guān)的細(xì)胞因子,也是與病理性瘢痕形成密切相關(guān)的細(xì)胞因子,有人證實(shí)增生性瘢痕的形成可能與組織中TNF-α表達(dá)低下有關(guān)。本研究采用版納微型豬近交系為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,模擬人皮膚建立創(chuàng)面模型,應(yīng)用SYBRgreen熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法構(gòu)建TNF-α基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,并且通過同時(shí)構(gòu)建內(nèi)參基因GAPDH的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正,從而為快速、靈敏、可靠的檢測(cè)TNF-α基因的表達(dá)情況,探討其在各種疾病中的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1皮膚創(chuàng)皮模型選取健康狀況良好的版納微型豬近交系4～6月齡豬5頭,麻醉后,備皮,用取皮刀去掉表皮至中厚皮,建立皮膚創(chuàng)面模型。然后再在取皮區(qū)的創(chuàng)面切取1.0～1.5mm厚、1cm×4cm面積的創(chuàng)面皮膚組織,液氮速凍,-80℃長(zhǎng)期保存。1.1.2ssr-pcrRNAisoplus、AgaroseGelDNApurificationkit、MiniBESTplasmidpurificationkit等試劑盒以及pMD18-TVector、E.colicompetentcellsDH5a、Amp、X-Gal、IPTG、TaqE、dNTPmixture、DL2000DNAmarker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa);SuperScriptTMⅢfirst-strandsynthesissystemforRT-PCR(Invitrogen);SYBRgreenPCRmastermix試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);熒光定量PCR儀為ABI7500。1.2方法1.2.1rna的提取利用RNAisoPlus提取皮膚組織總RNA。所有器械均用DEPC浸泡過夜,121℃高壓蒸汽滅菌30min。稱取皮膚組織100mg,將其用眼科剪刀剪碎,在研缽中用液氮反復(fù)速凍研磨至粉末狀,加入1mLRNAisoPlus,按試劑盒步驟提取出皮膚總RNA。取3μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)RNA的完整性;同時(shí)利用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.2基于depc-trate的雙軌菌株4.2用FirststrandcDNAsynthesiskit(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RNA、引物混合體系:2μg的TotalRNA,1μL的50μmol/Loligo(dT18),DEPC-treatedwater補(bǔ)齊至12μL,混勻,輕微離心,65℃溫育5min,迅速放于碎冰中1min。cDNA合成混合體系8μL:2μL的10mmol/LdNTPmix,4μL的5×reactionbuffer,1μL的200U/μLRevertAidTMM-MuLVreversetranscriptase,1μL20U/μL的RibolockTMRNaseinhibitor;將8μLcDNA合成混合體系加到RNA和引物混合體系中,混勻,42℃溫浴60min,70℃5min終止反應(yīng)。-20℃保存或立即用于PCR。1.2.3特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank豬TNF-αmRNA序列及內(nèi)參基因GAPDH序列,綜合應(yīng)用PrimerPremier5.0和Oligo6軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列信息見表1。1.2.4pcr擴(kuò)增dntps25μL擴(kuò)增反應(yīng)體系:2.5μL的10×buffer(Mg2+plus),2μL2.5mmol/L的dNTPs,10μmol/L引物各0.5μL,0.25μL5U/μLTaqE;2μLcDNA,17.25μLddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃5min;94℃30s,55℃1min,72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min;4℃終止反應(yīng)。1.2.5dna凝膠純化在紫外透射臺(tái)上用手術(shù)刀片切下TNF-α基因402bp及看家基因GAPDH183bp的膠塊,盡量切除不含DNA的凝膠,保證切下的膠塊純度較高。利用agarosegelDNApurificationkit純化目的片段,將其與pMD18-T載體連接,反應(yīng)體系10μL:1μLpMD18-Tvetor,3μL目的片段及看家基因,1μLddH2O,5μLligationmix。恒溫循環(huán)水浴16℃連接16h。1.2.6菌種x-gal-1全量10μL連接產(chǎn)物加入至40μLDH5a感受態(tài)細(xì)胞中,冰中放置30min,冰浴過程中搖勻3次,防止細(xì)胞沉底。42℃循環(huán)水浴熱擊45s后,再在冰中放置5min,加入950μLLB液體培養(yǎng)基(Amp-),37℃,200r/min,振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)1h,取100μL涂布于含有X-Gal(40mg/mL),IPTG(40mg/mL),Amp(100μg/mL)的LB瓊脂固體培養(yǎng)基上,將平板37℃恒溫培養(yǎng)箱正置1h待完全吸收后,倒置過夜培養(yǎng),形成單菌落。1.2.7原pcr檢測(cè)結(jié)果(1)小量培養(yǎng)細(xì)菌:用滅菌牙簽挑取5個(gè)生長(zhǎng)較孤立的白色菌落,各接種于含3mLLB液體培養(yǎng)基(Amp+)的玻璃試管里,37℃,200r/min,振蕩培養(yǎng)16h。(2)菌液PCR鑒定:以0.2μL菌液為模板,進(jìn)行PCR鑒定,其余反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與原PCR反應(yīng)體系和條件相同。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果為陽(yáng)性的進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。1.2.8重組質(zhì)粒酶切鑒定(1)質(zhì)粒提取:利用MiniBESTplasmidpurificationkit提取重組質(zhì)粒,用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的濃度及純度,測(cè)定10次取平均數(shù)確定為其實(shí)際濃度和純度,并且要求A260/280值在1.6～1.8之間。(2)酶切鑒定:用EcoRI和HindIII對(duì)純度較高的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切反應(yīng)體系20μL:10×buffer2μL,EcoRⅠ和HindⅢ各1μL,質(zhì)粒1μg,其余用ddH2O補(bǔ)齊。重組質(zhì)粒酶切采用37℃恒溫循環(huán)水浴,5～6h,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。(3)PCR鑒定:以重組質(zhì)粒為模板,進(jìn)行PCR鑒定,反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同原PCR反應(yīng)體系和條件,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。(4)測(cè)序鑒定:將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒菌液送北京百泰克生物技術(shù)有限公司,利用通用引物進(jìn)行序列測(cè)定(見圖1)。1.2.9實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)重組質(zhì)粒中熒光量的檢測(cè)通過下列公式計(jì)算質(zhì)粒的濃度。[公式中C為質(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度(ng/μL),M為質(zhì)粒DNA的堿基對(duì)數(shù)(空載體堿基對(duì)數(shù)+插入目的片段堿基對(duì)數(shù),本研究pMD18-T為2692bp,TNF-α插入目的片段為402bp,GAPDH插入目的片段為183bp),6.02×1023為阿佛加德羅常數(shù)]制備1010copies/μL數(shù)量級(jí)的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品原液,貯于-80℃?zhèn)溆?。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行10倍倍比稀釋成109～100copies/μL梯度數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),每個(gè)樣品3次重復(fù),在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增并進(jìn)行檢測(cè),反應(yīng)體系25μL:12.5μLSYBRgreenImix,10μmol/L引物各0.5μL,1μL標(biāo)準(zhǔn)品,10.5μLddH2O。擴(kuò)增參數(shù)為:95℃預(yù)變性15min;95℃變性15s;60℃退火30s;72℃延伸30s;76℃收集熒光30s。根據(jù)臨界循環(huán)數(shù)(thresholdcycle,Ct)及模板起始拷貝數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)方程。2結(jié)果與分析2.1s和抗條帶提取的取皮區(qū)創(chuàng)面組織總RNA可分辨28S、18S和5S條帶(見圖2)。A260/280值的范圍均在1.8-2.1之間,符合總RNA提取要求的純度,并符合逆轉(zhuǎn)錄的要求。2.2pcr檢測(cè)dna利用特異性引物以cDNA為模板和以菌液、提取的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的TNF-α及GAPDH經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),片段大小為402bp及183bp;用EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),也與預(yù)期結(jié)果相吻合,表明目的片段已與載體成功重組(以上結(jié)果見圖3)。2.3tnf-標(biāo)準(zhǔn)序列和創(chuàng)造材料的結(jié)構(gòu)將測(cè)得的TNF-α和GAPDH序列用Lasergene軟件的SeqMan與原設(shè)計(jì)引物的TNF-α標(biāo)準(zhǔn)序列EU632384和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)序列U48832進(jìn)行比對(duì),同源性均為100%。說(shuō)明目的片段已成功重組于載體中并保持了序列的完整性。測(cè)序峰圖結(jié)果(見圖4、5)。2.4熒光定量pcr檢測(cè)分別利用7個(gè)稀釋梯度的TNF-α基因標(biāo)準(zhǔn)品及5個(gè)稀釋梯度的GAPDH看家基因標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,得到了平行反應(yīng)擴(kuò)增過程的S形熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線(見圖6)。總體上顯示:所有曲線拐點(diǎn)清楚,指數(shù)增長(zhǎng)期明顯,空白對(duì)照擴(kuò)增曲線平直無(wú)上揚(yáng)。曲線指數(shù)期擴(kuò)增斜率大,說(shuō)明擴(kuò)增效率高;相鄰濃度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線之間的間距都十分接近理想斜率3.32。2.5熔解曲線的測(cè)量和產(chǎn)物特異性分析經(jīng)過熔解曲線測(cè)定,其Tm值分別為85.1℃及82.6℃,兩熔解曲線質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品主峰位置重疊,窄且尖,無(wú)雜峰,特異性較好(見圖7)。2.6重組質(zhì)粒濃度與ct值的關(guān)系建立的TNF-α基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=-3.082logX+34.604,其中Y代表Ct值,X代表模板量的對(duì)數(shù)值。其線性范圍達(dá)到7個(gè)數(shù)量級(jí),重組質(zhì)粒濃度在109～103copies/μL之間,其對(duì)數(shù)與相應(yīng)的Ct值(循環(huán)閾值),具有良好的相關(guān)性,決定系數(shù)R2為0.993,斜率為-3.082,接近標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的理想值-3.32,擴(kuò)增效率E為111.073%。同時(shí)建立的GAPDH看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=-3.423logX+42.326,其線性范圍達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí),重組質(zhì)粒濃度在109～105copies/μL之間(見圖8)。3實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果基因表達(dá)分析在生命科學(xué)的眾多研究領(lǐng)域中變得日趨重要,將為探索疾病相關(guān)基因、了解基因表達(dá)調(diào)控復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)、解析生命奧秘等提供有用的數(shù)據(jù)資料。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種新的核酸定量檢測(cè)基因表達(dá)技術(shù),用于mRNA轉(zhuǎn)錄水平的定量檢測(cè),它是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量分析目標(biāo)基因。該技術(shù)不僅對(duì)模板進(jìn)行了精確定量,而且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可靠、無(wú)污染、還能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高,可同時(shí)檢測(cè)大量樣品。目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。本研究選擇SYBRgreenI熒光染料進(jìn)行定量反應(yīng),不需要設(shè)計(jì)探針,降低了檢測(cè)的成本,使檢測(cè)方法也變的簡(jiǎn)便。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合,因此它也能與非特異性dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合,使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào),如果產(chǎn)物不純,有非特異性反應(yīng)產(chǎn)物及引物二聚體,則熔點(diǎn)峰范圍寬或有多個(gè)峰。為了避免這種假陽(yáng)性信號(hào),本研究采用熔解曲線和電泳分析,通過調(diào)整反應(yīng)體系和優(yōu)化反應(yīng)條件使PCR擴(kuò)增反應(yīng)的熔解曲線無(wú)雜峰,只有單一主峰,電泳無(wú)引物二聚體和非特異性條帶,從而消除了非特異性擴(kuò)增的假陽(yáng)性結(jié)果。進(jìn)行基因或蛋白水平表達(dá)分析時(shí),組織大小、細(xì)胞數(shù)量、實(shí)驗(yàn)環(huán)境或者實(shí)驗(yàn)效率等引起樣品加樣量的差異會(huì)直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于內(nèi)參基因在各組織和細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定,常被作為參照在real-timePCR、Northern印跡、原位雜交、核糖核酸酶保護(hù)分析、基因芯片等分子水平的表達(dá)分析時(shí)來(lái)校正加樣量等引起的誤差。最理想的內(nèi)參應(yīng)該是一種在生物體所有發(fā)育階段的不同組織表達(dá)水平都是恒定的、并且不受實(shí)驗(yàn)處理影響的基因,此基因表達(dá)水平還應(yīng)該與靶基因的表達(dá)水平接近。常用的內(nèi)參管家基因主要有β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)以及核糖體18SrRNA、28SrRNA等,GAPDH基因?yàn)閰⑴c糖酵解的一種關(guān)鍵酶,是最為常用的內(nèi)參基因之一,故本研究在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量過程中除擴(kuò)增靶基因TNF-α外,還擴(kuò)增了內(nèi)參基因GAPDH,并以靶基因定量所得的拷貝數(shù)與內(nèi)參基因的比值表示靶基因的表達(dá)水平來(lái)校正目標(biāo)基因的表達(dá)量。本研究通過T-A克隆方法構(gòu)建了pMD18-T和TNF-α基因的重組質(zhì)粒,用所提取的質(zhì)粒DNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)模板,具有純度高、來(lái)源廣、易于保存、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),可長(zhǎng)期用于檢測(cè)。經(jīng)過對(duì)質(zhì)粒模板進(jìn)行不同濃度梯度稀釋,檢測(cè)擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)性好,斜率達(dá)-3.082。檢測(cè)靈敏度達(dá)103拷貝,線性范圍為