不同類型大鼠動脈粥樣硬化模型的建立及比較分析

不同類型大鼠動脈粥樣硬化模型的建立及比較分析

附近雜交大鼠具有高度的純度和遺傳穩(wěn)定性。這是科學研究中不可或缺的實驗材料之一。HFJ近交系大鼠為河北省實驗動物中心歷經(jīng)十余年成功培育的高繁殖力大鼠近交系。HFJ起始親代來源于一對屏障環(huán)境下的封閉群Wistar大鼠,目前連續(xù)近親交配已繁殖到F30代。并在后期工作中對該近交系大鼠部分表型、部分血清免疫學指標和血液生理生化指標等進行了系列研究,為HFJ大鼠的開發(fā)應用提供了大量基礎資料。實驗研究發(fā)現(xiàn),HFJ大鼠具有自發(fā)高甘油三酯和高膽固醇特性(蔡月花等,2009;鄭龍等,2012),而高血脂是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)重要的危險誘因之一。膽固醇升高、低密度脂蛋白大量沉積是啟動和加速AS的重要標志。由于AS是大多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的前期病理基礎,并且發(fā)病機制尚未完全闡述清楚,因此選擇最適實驗動物,建立可靠的AS動物模型,對探討AS發(fā)病機制和研發(fā)防治新藥具有重要意義。本研究采用高脂飲食誘導法結合免疫損傷法分別建立HFJ大鼠和Wistar大鼠AS模型,通過比較分析兩種大鼠AS模型的特點和差異,為HFJ大鼠是否更適用于建立AS疾病動物模型提供實驗依據(jù)。1材料表面1.1動物實驗動物清潔級近交系HFJ大鼠和Wistar雄性大鼠各20只,日齡30～45d,由河北省實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(冀)2008-1-003。動物于屏障環(huán)境+IVC條件下飼養(yǎng)。實驗動物使用許可證號為SYXK(冀)2010-0026。飲水采用超濾處理無菌水,飼喂方式采用自由飲水和進食,人工照明各12h。動物實驗過程按照“3R”原則,實驗過程中給予人道關懷。采用隨機數(shù)字表方法,將HFJ和Wistar大鼠按體重隨機分為模型組和正常組,每組10只,實驗前予以普通飼料適應性喂養(yǎng)1周。1.2免疫刺激處理正常組喂飼普通飼料;模型組喂飼高脂飼料(15%豬大油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、2%蛋黃粉,70.3%的基礎飼料),參考王園園等(2008)采用牛血清白蛋白(40mg/kg)和卵清白蛋白(2.5mg/kg)進行共免疫刺激,1周后一次性灌注維生素D3(25萬U/kg)。以上動物飼料由河北省實驗動物中心提供,飼料生產(chǎn)許可證號:SYXK(冀)2008-2-001。1.3提取物和生物工程丙基硫氧嘧啶(Propylthiouracil,PTU)購自上海朝輝藥業(yè)有限公司,卵清白蛋白干粉(SigmaA5253)和牛血清白蛋白干粉(SigmaA7030)購自北京索萊寶科技有限公司,膽固醇購自北京鼎國公司,?；悄懰徕c購自北京奧博星公司,豬油購自雙匯集團,多聚賴氨酸、一抗、SP、Dab購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司。2實驗方法2.1心肌激酶和c-反應蛋白檢測采用KY-190型全自動生化分析儀(南京特康生化分析儀器有限公司)進行總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)檢測,所用試劑和方法按照說明書操作,心肌激酶、心肌激酶同工酶和C-反應蛋白測定試劑盒購自中生北控生物科技有限公司。2.2大鼠主動脈及心臟組織病理學檢測造模實驗12周后,稱重后用3%戊巴比妥鈉按40mg/kg劑量對大鼠進行腹腔注射麻醉,心臟采血后立即取完整主動脈(從主動脈根部至髂總動脈分叉處)和心臟組織(取冠狀溝至底部),于10%中性甲醛固定,做石蠟切片,HE染色并觀察形態(tài)學改變。2.3陽性細胞觀察大鼠主動脈弓用10%中性多聚甲醛固定48h(4℃),石蠟包埋,5μm切片,用SABC法對VEGF進行免疫組織化學染色。每次染色設陰性對照染色,PBS取代一抗,其他程序相同。封片后切片于400×光鏡下放大觀察,以細胞漿中出現(xiàn)條索狀、顆粒狀棕黃色染色為陽性細胞。染色結果判定采用免疫組化評分(IHS)方法(王園園等,2008),采用雙盲法隨機選擇5個高倍鏡視野(400×):A為陽性細胞數(shù)分級:0%～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4,B為陽性細胞顯色強度分級:0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性),IHS=A×B。應用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國MediaCybernetics公司Image-ProPlus)進行圖像采集。2.4因素方差分析分析統(tǒng)計處理采用SPSS12.0軟件,實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,成組設計的多個樣本均數(shù)比較在方差齊性的基礎上作單因素方差分析,多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用SNK法。3結果3.1體質(zhì)量在實驗期間的回降趨勢大鼠高脂喂養(yǎng)90d后處死,處死前禁食12h,稱量體重,處死后快速心臟取血用于生化指標測定。HFJ和Wistar大鼠模型組與正常組相比較,體質(zhì)量在實驗末期差異顯著(P<0.01),模型組體質(zhì)量在實驗后期出現(xiàn)回降趨勢(圖1)。HFJ與Wistar大鼠正常組相比較,前者TG、LDL-C水平高于后者(P<0.05),HFJ與Wistar大鼠模型相比較,TG、TC水平接近,前者LDL-C較后者升高明顯(P<0.05)(表1)。3.2兩組k-mb和crp的比較實驗結束后對各組心肌損傷指標進行檢測,CK和CK-Mb在正常組和模型組間水平差異有顯著性(P<0.05),而與炎性相關的指標CRP在正常組和模型組間差異不明顯(P>0.05)(表2)。3.3大鼠主動脈弓切片he染色結果大鼠心臟切片HE染色結果顯示(圖2),光學顯微鏡下觀察Wistar大鼠和HFJ大鼠正常組心臟血管內(nèi)膜光滑,未見增厚(圖2,B、D);而Wistar大鼠模型組血管內(nèi)膜增生、基層增厚,血管狹窄;HFJ模型組可見血管內(nèi)皮細胞排列紊亂、基層增厚,成纖維細胞活躍,內(nèi)膜下可見脂肪空泡,血管狹窄(圖2,A、C)。大鼠主動脈弓切片HE染色結果顯示(圖3),Wistar大鼠正常組可見主動脈壁各層結構正常,內(nèi)膜光滑,內(nèi)皮細胞完整,中層平滑肌細胞排列整齊、無增生,中膜彈力纖維正常(圖3,A、B)。HFJ大鼠正常組內(nèi)膜稍有斷裂,各層結構清晰完整,未見增殖病變(圖4,A、B)。Wistar大鼠模型組可見主動脈弓處于AS病理Ⅱ期,由于中層平滑肌細胞嵌入內(nèi)膜形成內(nèi)膜纖維帽,巨噬細胞聚集到纖維帽下方吞噬脂質(zhì)空泡形成泡沫細胞,纖維細胞嵌入內(nèi)動下形成肌源性泡沫細胞,中層平滑肌細胞增生紊亂,部分平滑肌及彈力纖維斷裂,伴泡沫細胞形成,內(nèi)膜增厚并部分脫落(圖3,C、D)。HFJ大鼠模型組與Wistar大鼠模型組相比,明顯處于AS病理Ⅲ期,可見內(nèi)膜增生、斷裂,纖維帽形成,纖維帽下具有典型的膽固醇結晶裂隙,脂質(zhì)空泡和片狀壞死物質(zhì)(以平滑肌細胞為主)形成粥糜樣物質(zhì),可見典型泡沫細胞和少量淋巴細胞,中層平滑肌排列紊亂,向內(nèi)膜遷移,彈力板發(fā)生斷裂、崩解(圖4,C、D)。3.4不同強度下內(nèi)皮細胞和平滑細胞的染色結果HFJ和Wistar大鼠模型組VEGF染色陽性細胞數(shù)較正常組明顯增加,棕色強度增加,內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞均呈強陽性染色,差異明顯(P<0.05),具有統(tǒng)計學意義(表3)。HFJ大鼠模型組切片位置為斑塊處,可見脂質(zhì)空泡,VEGF染色陽性細胞彌漫于紊亂血管壁內(nèi),陽性細胞數(shù)較Wistar模型組多(圖5)。4hfj大鼠動物模型的構建目前對于AS發(fā)病機制尚存爭議,但是,多數(shù)學者認為AS與內(nèi)皮細胞功能發(fā)生紊亂后的炎癥反應及在此基礎上的損傷-修復過程有關(趙娟,任立群,2008)。進入二十一世紀以來,AS性心血管疾病已成為嚴重危害人類健康的第一位殺手,其發(fā)病機制及治療的研究一直是醫(yī)學界的熱點,所以建立理想的AS動物模型尤為重要。AS模型動物選擇較多,如豬、猴、家兔、鵪鶉、大鼠和小鼠等,但在AS研究中各自存在優(yōu)點和不足,其中家兔、基因缺陷性小鼠和大鼠應用最為廣泛(傅劍云等,2009)。但是由于家兔的食性和生理解剖特點與人類差異較大,基因缺陷性小鼠價格昂貴且死亡率高,大鼠作為AS模型動物顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。大鼠無膽囊的缺陷,可以通過在飼料中添加抑制甲狀腺藥物(如甲硫咪唑、甲基硫氧嘧啶和PTU等)(溫進坤等,2001;劉劍剛等,2004;章義利等,2007)來提高對膽固醇的吸收能力。現(xiàn)在國內(nèi)多應用Wistar大鼠和SD大鼠,選擇多因素結合方法復制大鼠AS模型:高脂飲食誘導高脂血癥并形成AS早期病變,免疫損傷或致敏方法造成血管內(nèi)皮的炎性損傷,鈣超載和鐵超載促進動脈壁的脂質(zhì)沉淀和斑塊形成等。對12周齡成熟HFJ近交系雄性大鼠進行血液生化指標檢測發(fā)現(xiàn),TG、TC、LDL-C和VLDL-C(極低密度脂蛋白)水平均明顯高于Wistar雄性大鼠(陳貴良等,2011),不同品系和性別大鼠之間血液指標存在差異已被廣泛證實。血脂異常也是AS的主要誘因之一,臨床上血清高TG、高LDL-C、低HDL-C是動脈粥樣硬化特征性的脂質(zhì)三聯(lián)征(楊波等,2005)。所以利用HFJ雄性大鼠高血脂的特性,復制AS大鼠動物模型并對其適用性與Wistar大鼠進行比較研究,有可能為建立理想的AS動物模型提供方便。本實驗采用高脂飲食、免疫損傷,并輔以VD3的方法進行造模。實驗90d后,通過血清生化指標檢測,HFJ大鼠正常組與Wistar大鼠正常組相比較TG、TC和LDL-C水平升高,說明HFJ大鼠具有自發(fā)高血脂傾向;并且HFJ大鼠模型組LDL-C及TG高于Wistar大鼠;但模型組TG水平顯著低于正常組。分析其原因可能是藥物影響,由于模型組應用PTU對甲狀腺功能進行抑制,復制AS大鼠模型PTU的常規(guī)用量(占高脂飼料總質(zhì)量的0.2%,自由采食90d)與甲減大鼠模型常規(guī)用量(15～30mg/kgi.p.,用藥時間15d)(Gilbert&Paczkowski,2003;G?kseletal.,2006)相比顯著過高。適量攝取PTU抑制甲狀腺功能,可以導致肝臟甘油三酯脂肪酶(HTGL)活性降低,清除TG能力降低。但是過量攝取PTU會對大鼠機體造成更大的損傷,如心肌功能受損、肝腎功能受損、攝食量減少、體質(zhì)量減輕、精神抑郁等。相對正常組,模型組動物在實驗后期攝食量驟減、體質(zhì)量減輕,可能是直接導致TG水平降低的主要原因。并且對血清中CK和CK-Mb進行檢測,對心臟進行病理檢測,也證實模型組心肌功能受到嚴重損傷,模型組部分大鼠出現(xiàn)心包積液,這與甲減型心臟病特征(張劼等,2005)相符。建立良好的動物模型應在盡量減少對機體其他器官的損害為前提下,造成靶器官的損傷及病變,最大程度接近人類自然發(fā)病狀態(tài)。因此,PTU的最佳用量仍需要進一步研究。VEGF與AS的發(fā)生密切相關,因為發(fā)生AS損傷的動脈中膜內(nèi)的滋養(yǎng)血管數(shù)目增加,同時粥樣斑塊內(nèi)血管增生活躍,而VEGF是介導血管生成的重要因素,可強烈促使血管內(nèi)皮細胞進行有絲分裂(李京佳等,2012)。并且VEGF特異地作用于血管內(nèi)皮細胞,不僅能誘導血管新生,還能增加血管通透性,因而可以促進炎性細胞向動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)遷移、浸潤,并分泌一些細胞因子,如腫瘤壞死因子(αtumornecrosisfactor,TNF-α)等,這些因子反過來又可促進斑塊內(nèi)血管的生成,高血脂癥及AS病變過程均伴隨VEGF表達的增加。觀察實驗末期各組動脈血管中VEGF免疫組化結果,模型組陽性表達較多(P<0.05),差異明顯,VEGF表達在血管壁各層次,如平滑肌細胞、巨噬細胞等,而正常組主要表達在血管內(nèi)皮;并且HFJ大鼠模型組較Wistar大鼠模型組陽性表達較多(P<0.05),差異明顯。本實驗通過血清生化指標、病理學及免疫