中國(guó)三大實(shí)驗(yàn)用小型豬線粒體dnadloop多態(tài)性分析

中國(guó)三大實(shí)驗(yàn)用小型豬線粒體dnadloop多態(tài)性分析

經(jīng)過(guò)發(fā)現(xiàn)，倫琴骨（mtsda）作為核外遺傳材料的中心材料已成為核外遺傳研究的熱點(diǎn)。目前,已對(duì)人(Crespilloetal.,2000)和豬(Ursingetal.,1998)、馬、小鼠、大鼠、牛、雞等20多種動(dòng)物mtDNA進(jìn)行了全序測(cè)定。對(duì)豬mtDNA控制區(qū)(D-loop)序列的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能作了較深入的研究,Mackay等(1986),Ghivizzani等(1993)和Takeda等(1995)分別測(cè)定了mtDNA控制區(qū)5′端、3′端和全序。其物理結(jié)構(gòu)可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)共編碼37個(gè)基因,非編碼區(qū)即線粒體基因組的控制區(qū),也稱D-loop,它位于mtRNA的tRNApro和tRNAphe之間,占mtDNA的6%左右,富含A-T堿基,遺傳上是高變區(qū),其堿基替換率比mtDNA其它區(qū)域高5～10倍,控制mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。因此對(duì)D-loop的研究受到廣泛關(guān)注。Davoli等(1986)和趙興波等(1997)等作了mtDNAD-loopPCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)分析,Lan等(1993)和勞為德等(1981)等對(duì)豬mtDNA進(jìn)行了RFLP分析研究,Takeda等(1995)等對(duì)部分豬進(jìn)行了mtDNAD-loopPCR-SSCP(single-strainconformationpolymorphism)和PCR直接測(cè)序分析。但對(duì)我國(guó)獨(dú)特的小型豬如廣西巴馬小型豬、西雙版納近交系小耳豬和貴州小型香豬的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文意在設(shè)計(jì)引物對(duì)豬mtDNAD-loop區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,應(yīng)用PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR直接測(cè)序分析其多態(tài)性,建立各品種品系豬的核外遺傳標(biāo)記,為豬品種品系鑒定提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1品種品系豬西雙版納近交系小耳豬(JS系和JB系各6頭)、廣西巴馬小型豬(6頭)、貴州小型香豬(實(shí)驗(yàn)用香豬和民間香豬各6頭)和長(zhǎng)白豬(6頭)等4個(gè)品種品系豬,分別由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾養(yǎng)志教授、廣西大學(xué)王愛(ài)德教授、貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院甘世祥教授和重慶市種豬場(chǎng)提供。1.1.2儀器美國(guó)PE2400型PCR儀,ABIPRISMTMDNA測(cè)序儀。1.1.3選擇性內(nèi)切酶試劑Taq酶、10×Buffer、MgCl2、dNTP、23種限制性內(nèi)切酶(所用酶見(jiàn)表1)中23種為德國(guó)BM公司出品,HincⅡ?yàn)镻romega公司生產(chǎn),其它試劑均為分析純。1.2方法1.2.1樣品采集與總dna制備野外采血血樣保存和總DNA制備參照劉中祿等(1999)的方法進(jìn)行。1.2.2mtcda片段的擴(kuò)增和引物的篩選參照Uring等(1998)等測(cè)定的豬mtDNA全序(16680bp)設(shè)計(jì)引物,P1:5′-AGACTAACTCCGCCATCAG-3′(15380～15398bp)和P2:5′-CGCGGATACTTGCATGTGT-3′(114～132bp),擴(kuò)增的mtDNA片段為1480bp左右。mtDNAD-loop5′端擴(kuò)增用引物P3:5′-GTACATAGCACATATCATGTC-3′(15686～15706bp)和P4:5′-TAAGGGGAAAGAGTGGGCGAT-3′(15893～15913bp)引用Takeda(1995)等的引物,擴(kuò)增片段為227bp。引物由上海細(xì)胞生物研究所合成。1.2.3模板dna的制備反應(yīng)總體積50μl,內(nèi)含dNTP200μmol/L,引物0.5μmol/L,Mg2+1.5mmol/L,模板總DNA200ng。按94℃5min,30循環(huán)的94℃1min、58℃1min和72℃2min,接72℃7min后4℃保存的擴(kuò)增程序進(jìn)行。1.2.4瓊脂糖平板凝膠的制備取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl,加2μl的限制性內(nèi)切酶和2μl10倍酶切緩沖液,加滅菌雙蒸水至20μl,37℃溫育4h。配制2%瓊脂糖平板凝膠,電泳緩沖液為1×TBE,pH8.0。電壓為5V/cm。溴化乙錠染色,紫外燈下觀察、拍照。1.2.5變性緩沖液5′端PCR-SSCP分析取豬mtDNAD-loop5′端PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl,TE(pH8.0)稀釋10倍,取消2μl稀釋液加12μl變性緩沖液(95%去離子甲酰胺,20mmol/LNaOH,0.025%二甲苯藍(lán),0.025%溴酚藍(lán)),混勻,100℃5min后立即放入冰水中,直至電泳。取5μl變性后樣品,用8%聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶N,N-亞甲雙丙烯酰胺=49∶1,含5%甘油)25℃,50V恒壓電泳,電泳結(jié)束后銀染顯色。1.2.6pcr和測(cè)序5′端PCR直接測(cè)序西雙版納近交系小耳豬、廣西巴馬小型豬、貴州小型香豬各取一個(gè)mtDNAD-loop5′端PCR產(chǎn)物,經(jīng)1.2%低溶點(diǎn)瓊脂糖純化回收,用ABIPRISMTM測(cè)序儀直接測(cè)序,引物仍用P3和P4。2結(jié)果2.14d-loop長(zhǎng)度采用引物P1和P2擴(kuò)增mtDNAD-loop,擴(kuò)增所得片段為1480bp左右,與已報(bào)道的D-loop長(zhǎng)度一致。用23種限制性內(nèi)切酶消化36頭豬mtDNAD-loop,均表現(xiàn)為單態(tài),其限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果見(jiàn)表1。2.24mtd-loop5豬pcr-sp的結(jié)果如圖1所示,除長(zhǎng)白豬外,其它各品種品系豬之間SSCP未見(jiàn)差異。2.3個(gè)中國(guó)豬端基差異如圖2所示,三種小型豬mtDNAD-loop5′端序列完全一致,與長(zhǎng)白豬、大白豬有4個(gè)堿基差別,與杜洛克差別3個(gè)堿基,與Gottingen小型豬差別2個(gè)堿基,與中國(guó)梅山豬差別1～2個(gè)堿基。3豬d-loop的遺傳相關(guān)性研究制備總DNA用于豬mtDNA控制區(qū)的擴(kuò)增。由于豬mtDNA分子量小(16.5kb),處于限制性內(nèi)切酶分析范圍,所以目前研究多集中在mtDNA-RFLP,但mtDNA提取純化繁雜。本實(shí)驗(yàn)采取制備血液總DNA(含mtDNA)樣品,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增mtDNAD-loop區(qū)域,省去了mtDNA繁瑣的提取純化工作。但切記注意乙醇沉淀總DNA離心時(shí),離心力應(yīng)12000×g以上,以防m(xù)tDNA的丟失。豬mtDNAD-loopRFLP分析。通過(guò)mtDNAD-loopRFLP分析,各品種品系豬之間和內(nèi)部,未發(fā)現(xiàn)酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性,證明各豬種D-loop酶切多態(tài)貧乏。而趙興波等(1997)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)白豬存在一個(gè)AccⅠ酶切位點(diǎn),而其它品種品系豬則未發(fā)現(xiàn)這一酶切位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Davoli等(1995)的研究結(jié)果不一致,在HincⅡ和HaeⅢ酶切位點(diǎn)上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的存在。通過(guò)Genebank查到Takeda(1995)、Ghivizzani等(1993)和Mackay等(1986)測(cè)定的梅山、大約克夏、長(zhǎng)白等豬的D-loop序列,通過(guò)PRIMER軟件模擬各品種豬D-loop限制性內(nèi)切酶圖譜,通過(guò)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)的23種限制性內(nèi)切酶與PRIMER軟件模擬的結(jié)果完全一致,從而也驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增mtDNAD-loop的正確性。本實(shí)驗(yàn)證明,PCR-RFLP雖能表現(xiàn)清晰的結(jié)果,但只能檢定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的突變或差異,識(shí)別位點(diǎn)以外的差異則無(wú)能為力。而且D-loop堿基數(shù)目少,酶切位點(diǎn)少,可能是酶切多態(tài)貧乏的原因之一。Lan等(1993)等用mtDNA-RFLP分析表明,作為衡量一個(gè)群體的mtDNA變異程度的一個(gè)指標(biāo)的限制性類型間的平均遺傳距離(P)為0.004,是哺乳動(dòng)物中已報(bào)道的最低值。π值作為衡量一個(gè)給定群體和mtDNA多態(tài)性的更好指標(biāo),豬的為0.122%,以往研究中人類被作為是多態(tài)性程度最低的一個(gè)極端例子,其π值介于0.15%～0.47%之間,也比豬的π值大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示豬mtDNAD-loopRFLP貧乏,與蘭宏的結(jié)果一致。表明豬mtDNA群體分化程度處于一個(gè)相當(dāng)?shù)偷乃?同時(shí)反應(yīng)了它們母系遺傳的一致性。SSCP分析是檢查序列差異的有效手段,3種小型豬SSCP構(gòu)象的一致并與長(zhǎng)白豬表現(xiàn)出差異,符合目前對(duì)豬種的兩種母系起源的理論,即歐洲和亞洲野豬。并說(shuō)明3種小型豬親源關(guān)系較近,在起源和進(jìn)化上的一致性。但不能用該方法較好地鑒別3種小型豬。對(duì)3種小型豬mtDNAD-loop5′端高變區(qū)227bp片段進(jìn)行PCR直接測(cè)序,發(fā)現(xiàn)3種小型豬序列完全一致,與長(zhǎng)白豬差別最大(4個(gè)堿基差別),與中國(guó)梅山豬最為接近(1～2個(gè)堿基差別),同屬于C型,此結(jié)果與SSCP分析結(jié)果