藥物毒性的代謝組學(xué)研究-中國藥理學(xué)會毒理學(xué)研討會

藥物毒性的代謝組學(xué)研究彭雙清軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所國家北京藥物安全評價研究中心劑量藥物毒物藥物發(fā)現(xiàn)與發(fā)展新化學(xué)實體(NCEs)新生物實體(NBEs)有效性安全性藥效學(xué)毒理學(xué)管理規(guī)范ICH

(InternationalConferenceonHarmonization)100,000NCEs臨床前研究100人體研究(0.1%)10-20個新藥投入市場(0.01-0.02%)藥物發(fā)現(xiàn)發(fā)展過程中候選新藥的淘汰率2個新藥利益回報(0.002%)早期發(fā)現(xiàn)臨床前臨床試驗投放市場市場后

IVIIIIIICSFHDRSToxicology6-15Ys早期毒理學(xué)研究(nondefinitivetoxicologyprofile)正式毒理學(xué)評價(definitivetoxicologyevaluation)通過給予一定數(shù)量的實驗動物大劑量的待測化合物，觀察其毒性效應(yīng)特征，然后將其實驗結(jié)果外推到接受小劑量相同化合物的大量人群。藥物安全性評價

存在問題種屬外推劑量外推實驗周期費用昂貴

發(fā)展方向靈敏度高特異性強周期短Inputs:Noxiousagent/StressorOutputs:Biologicalendpoints;PathologyGeneexpressionProteinprofileMetabolicprofileTimeTime代謝組學(xué)(Metabonomics)?定量研究機體對病理生理刺激或遺傳變異的，與時間相關(guān)的多參數(shù)代謝應(yīng)答(Nicholson,etal,Xenobiotica,1999,29,1181-1189).?通過分析機體生物組織液體中代謝產(chǎn)物譜的變化，研究機體整體生物學(xué)狀況和功能調(diào)節(jié)。?利用核磁共振和模式識別方法對生物體液進行系統(tǒng)研究，了解由外源性物質(zhì)(藥物)的作用而引起的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，并將這種變化與核磁共振譜圖的模式對應(yīng)起來，從而找出作用的靶器官和作用位點，進而確定與之相關(guān)的生物標(biāo)志物?；驹?/p>

藥物毒性破壞正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能，改變細(xì)胞代謝途徑中內(nèi)源性代謝物的穩(wěn)態(tài)。體內(nèi)某種生物分子或代謝物的動態(tài)變化可以作為毒性損傷的評價指標(biāo)。血漿或尿液代謝物的“整體模式”比單一靶標(biāo)具有更好的一致性和預(yù)見性。關(guān)鍵技術(shù)

NMR與模式識別是實現(xiàn)代謝組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)手段。

(JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002)樣本采集譜圖采集統(tǒng)計分析生物標(biāo)志物量化處理肝、腎毒性的代謝組學(xué)檢測JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002

大鼠尿液功能性NMR圖譜大鼠尿樣的600兆NMR氫譜,圖中標(biāo)示的為各種病理生理條件下的生物標(biāo)志物,一張譜圖可包含數(shù)百種有關(guān)疾病和中毒過程的信息

。(JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002)技術(shù)特點與應(yīng)用

特點:無傷害性，快速簡便，動態(tài)檢測。應(yīng)用:基因功能研究

●疾病診斷毒理學(xué)研究:

確定毒性靶器官；確定作用靶位及其機制;確定毒性作用生物標(biāo)志物；評價毒性效應(yīng)過程(啟動、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸)。藥物安全性評價:早期毒性實驗；快速動物模型篩選；先導(dǎo)篩選優(yōu)化；發(fā)現(xiàn)臨床前新安全標(biāo)志物；作用機制；代謝類型；臨床安全性監(jiān)測；等等。異煙肼和利福平聯(lián)合用藥致肝毒性增加的代謝組學(xué)

近十年來，結(jié)核病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重反彈。異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampin，RFP)是WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核化療方案中不可替代的一線抗結(jié)核藥。兩藥聯(lián)合對殺滅結(jié)核桿菌有協(xié)同效果，可延緩耐藥性的產(chǎn)生。但聯(lián)合用藥可明顯增加肝毒性，甚至可發(fā)生嚴(yán)重的藥物性肝炎，出現(xiàn)致命的急性肝壞死并肝功能衰竭。關(guān)于RFP與INH合用肝毒性增加的機制研究已有30多年，但目前在很多方面，還未得到公認(rèn)和肯定。實驗設(shè)計劑量設(shè)計：Group1:control;Group2:INH400mg/kg;Group3:RFP100mg/kg;Group4:INH+PFP400+100mg/kg實驗動物：Wistar大鼠給藥時間:14dINH與RFP聯(lián)合用藥對大鼠體重和肝指數(shù)的影響分組體重(15d)(g)肝指數(shù)(mg/g)Con249.54±14.67@4.138±0.05@INH193.30±20.98*4.416±0.04*

@RFP215.92±7.36*@4.394±0.03*

@INH+RFP187.94±16.40*4.784±0.15*

N=5;*P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.INH與RFP聯(lián)合用藥對大鼠血漿生化指標(biāo)的影響分組ALT(U/L)ALP(U/L)TG(U/L)TBILI(U/L)Con15.80±3.83@274.00±51.44@0.13±0.084.72±0.73@INH32.60±2.70*335.60±52.63*0.67±0.27*@5.66±0.61*@RFP26.20±5.53*@276.20±31.16@0.21±0.064.42±0.51@INH+RFP38.20±4.82*348.00±43.86*0.26±0.1113.02±0.52**P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.

INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥對大鼠肝勻漿MDA、總巰基、非蛋白巰基和蛋白巰基含量的影響

*P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥對大鼠微粒體細(xì)胞色素P450含量及P4502E1活性的影響

*P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.組織病理學(xué)結(jié)果A:controlratsshowingnormalmorphology.B:400mg/kg/dayINHfor14days.Notethenecrosisfocus.C:100mg/kg/dayRFPfor14days.Noobviousnecrosis.D:400mg/kg/dayINHand100mg/kg/dayRFPfor14days.Notethenecrosisfocusandbigandsmallblankarea.

INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組尿液600MHz1H核磁共振譜

對照組(N)與給藥組(I=INH400mg/kg/d,R=RFP100mg/kg/d,P=INH+RFP400+100mg/kg/d)共14天(0=0d,1=1d,…14=14d)尿樣的PCA分析結(jié)果INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組不同時間點尿液代謝組變化主成分分析散點分布圖（給藥14d）INH組主成分分析的時間變化軌跡圖（連續(xù)給藥14d）

N＝control,

I=INH;0=0d,1=1d,…14=14d

RFP組主成分分析的時間變化軌跡圖（連續(xù)給藥14d）

N＝control,

R=RFP;0=0d,1=1d,…14=14dINH和RFP聯(lián)合用藥主成分分析時間變化軌跡圖（連續(xù)給藥14天）

N＝control,

P=INH+RFP;0=0d,1=1d,…14=14dloading

圖INH組尿液代謝產(chǎn)物主成分分析載荷分布圖

RFP組尿液代謝產(chǎn)物主成分分析載荷分布圖

loading

圖INH和RFP聯(lián)合用藥組尿液代謝產(chǎn)物主成分分析載荷分布圖

loading

圖INH組RFP組INH和RFP組1H譜的化學(xué)位移(δ)代謝產(chǎn)物PCA結(jié)果1H譜的化學(xué)位移(δ)代謝產(chǎn)物PCA結(jié)果1H譜的化學(xué)位移(δ)代謝產(chǎn)物PCA結(jié)果2.54citrate

2.462-OG

2.42succinate2.66citrate2.54citrate2.462-OG2.7citrate

2.7citrate

2.54citrate3.26taurine3.022-OG2.66citrate3.42taurine

2.7citrate3.66glucose3.022-OG3.26taurine：與對照比較，代謝產(chǎn)物濃度增加；：與對照比較，代謝產(chǎn)物濃度降低

2－OG：2－oxoglutarate表31HNMR檢測INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組化學(xué)位移變化的PCA結(jié)果結(jié)果表明：·對NMR譜圖進行主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)，INH和RFP單獨及聯(lián)合用藥組與對照組在分值散點圖中呈聚類型分布，各組間未見重疊，可明顯分離；·代謝產(chǎn)物譜與血液生化、肝臟脂質(zhì)過氧化、肝臟微粒體酶活性及組織病理學(xué)具有良好的相關(guān)性；·盡管使用傳統(tǒng)生物分析方法較容易檢測到一些代謝物，但是藥物處理組尿液的NMR譜圖卻可以提供毒物所誘發(fā)生化紊亂的顯著特征性信息和時效模式?！ねㄟ^600MHz1HNMR檢測INH與RFP單獨及聯(lián)合用藥組尿液的生化組成的顯著變化?！NH-:?；撬?)*,檸檬酸(),葡萄糖()·RFP-:2-酮戊二酸(),檸檬酸鹽()·INH+RFP:?；撬?)*,琥珀酸鹽(),2-酮戊二酸(),檸檬酸鹽()*尿液中?；撬釢舛鹊脑黾颖还J(rèn)為是肝中毒的標(biāo)志。關(guān)木通的腎毒性關(guān)木通馬兜鈴科馬兜鈴屬植物東北馬兜鈴的干燥藤莖含馬兜鈴酸（aristolochicacid）Ⅰ、Ⅳ、B、D，馬兜鈴甙（aristoloside），青木香酸（debilicacid）“中草藥腎病”“馬兜鈴酸腎病”含有馬兜鈴酸的中草藥（廣防己、關(guān)木通等）引起的腎功能損害：貧血、腎性糖尿腎間質(zhì)纖維化、腎小管破壞腎小管性蛋白尿國內(nèi)外反應(yīng)：許多國家禁止進口和銷售含馬兜鈴酸的中藥國家藥品監(jiān)管局取消關(guān)木通藥用標(biāo)準(zhǔn)“龍膽瀉肝丸”換方10/14/2023實驗設(shè)計劑量設(shè)計：36g/kg；32g/kg；28g/kg；control實驗動物：Wistar大鼠給藥時間:6dRatstreatedwithdrugfor6days.**P<0.01,comparedwithcontrol.關(guān)木通對大鼠血漿生化指標(biāo)的影響B(tài)UN(mM/L)

Crea(μmol/L)CON

7.38±2.9154.72±4.94

36g/kg

40.91±8.59**414.47±79.13