質(zhì)粒DNA的小量快速提取

質(zhì)粒DNA的小量快速提取第五次實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒DNA的小量快速提取制備目的：為了證實(shí)所得的轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒DNA是否確實(shí)由載體質(zhì)粒與目的基因組成，已排除其它可能方式的連接。常用鑒定方法：小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析；

互補(bǔ)；插入失活；雜交篩選。正常重組DNA：經(jīng)酶切電泳，可獲得5.4kb的載體和1.1kb的目的基因。錯(cuò)誤基因插入：不能酶切或片段大小不同。反向連接（出現(xiàn)在平端連接）：不被酶切或片段大小不同。載體自我環(huán)化：沒(méi)有小片段。一、基因工程簡(jiǎn)介概念：應(yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子(復(fù)制子replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。也稱(chēng)基因克隆或重組DNA

(recombinantDNA)

過(guò)程

特點(diǎn)1.連續(xù)性2.微量操作3.防止污染

化學(xué)試劑外源DNA生物公害載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體等。質(zhì)粒的特點(diǎn)細(xì)菌細(xì)胞染色體外的共價(jià)的閉合的環(huán)狀的dsDNA分子，能自主的自我復(fù)制并表達(dá)，并能穩(wěn)定的遺傳給子代。二、堿變性法的原理主要利用變性和復(fù)性的差異分離染色體DNA和質(zhì)粒DNA分子染色體DNA質(zhì)粒DNApH12.6完全變性不完全變性雙鏈完全解開(kāi)雙鏈局部解開(kāi)pH4.8不能復(fù)性復(fù)性NaAc高鹽纏連網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)溶解沉淀其他雜質(zhì)的去除細(xì)菌細(xì)胞破壞后，細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)，除了DNA外，還有RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器碎片、可溶性雜質(zhì)如糖、有機(jī)酸堿及鹽分等。這些都必須通過(guò)相應(yīng)的技術(shù)手段去除。堿變性中所用的NaOH-SDS溶液還可沉淀大分子RNA及部分蛋白質(zhì)。酚、氯仿可去除蛋白質(zhì)。無(wú)水乙醇、異丙醇可沉淀核酸，去除可溶性雜質(zhì)。兩者的區(qū)別？RNase可降解RNA。操作步驟：見(jiàn)P100關(guān)鍵詞EP管、EP離心機(jī)、微量移液器（加樣槍?zhuān)?、Tip頭（槍頭）、震蕩器等溶液1溶液2溶液3-20,10min12000rpm,10min質(zhì)粒DNA的酶切一、原理限制性核酸內(nèi)切酶定義：識(shí)別dsDNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng),限制外源DNA,保護(hù)自身DNA。分類(lèi)：Ⅰ、Ⅱ(重組DNA技術(shù)中常用)、ⅢⅡ類(lèi)酶作用特點(diǎn)能在特殊位點(diǎn)識(shí)別和切斷dsDNA，識(shí)別序列4-6bp，具有回文結(jié)構(gòu)（180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)）HindⅢ

產(chǎn)生5‘粘性末端AAGCTTTTCGAASstⅠGAGCTCCTCGAG產(chǎn)生3’粘性末端GTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口酶的命名以酶所來(lái)源的微生物的學(xué)名進(jìn)行命名。第一個(gè)大寫(xiě)字母是來(lái)源菌的種名的第一個(gè)字母；接著的兩個(gè)小寫(xiě)字母，是屬名的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母或數(shù)字代表株系；最后的羅馬數(shù)字代表在同一菌株中發(fā)現(xiàn)的酶的編號(hào)（通常按發(fā)現(xiàn)的先后順序）如在Haemophilusinfluenzaed株中發(fā)現(xiàn)的第三種限制酶（Ⅲ），被稱(chēng)作HindⅢ。酶活性單位指在限定條件下（溫度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量稱(chēng)為一個(gè)酶單位（unit）。實(shí)際工作中，為保證消化完全，1ugDNA的消化需要3-5個(gè)單位的酶，反應(yīng)時(shí)間也要適度延長(zhǎng)，通常是反應(yīng)過(guò)夜。酶切反應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)酶通常保存在50%的甘油中（？），使用時(shí)甘油濃度必須小于5%，故酶至少稀釋10倍。實(shí)際酶的用量應(yīng)是理論用量的3-5倍。Buffer通常是10×，使用時(shí)稀釋10倍?？偡磻?yīng)體積20-50ul，不足用d3H2O補(bǔ)足。注意加樣順序?；靹蚍磻?yīng)物。二、操作步驟：見(jiàn)P101-102可在酶解系統(tǒng)中同時(shí)加入RNase進(jìn)行RNA降解。注意控制反應(yīng)的條件。酶切體系的設(shè)計(jì)質(zhì)粒DNA10ul（10ug)HindIII(20U/ul)2ul10x緩沖液

2ul三蒸水6ul_____________________________________總體積

20ulDNA片段的瓊脂糖凝膠電泳一、原理分離原理：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)顯色原理：溴化乙錠（EB）