電泳技術(shù)在藥物分析中的應用

電泳技術(shù)在藥物分析中的應用

生檢室：姚世霞

引言 電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學家Re?ss進行了世界上第一次電泳實驗）。1937年，瑞典生化學家Tiselius發(fā)明了Tiselius電泳儀，在此基礎上建立了研究蛋白質(zhì)的自由界面電泳方法，利用該法首次證明人血清是由白蛋白、α、β、γ球蛋白組成，并因此于1948年獲得諾貝爾獎。隨后電泳技術(shù)的發(fā)展突飛猛進,特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學、醫(yī)學、免疫學等領域得到了廣泛應用。一.電泳的概念二.電泳技術(shù)基本原理三.電泳技術(shù)分類四.幾種常見電泳方法的比較五.電泳技術(shù)在藥物分析中的應用一.電泳的概念電泳：帶電粒子在電場中向著與其本身電荷相反的電極移動的過程。電泳技術(shù)優(yōu)點：快速、準確、重現(xiàn)性好+-二.電泳技術(shù)基本原理1.原理：

不同的帶電顆粒在同一電場中泳動速度，主要與其所帶凈電荷量，分子量及分子形狀有關(guān)。

pH>pI分子帶負電荷,在電場中向正極移動;

pH<pI分子帶正電荷,在電場中向負極移動;

泳動速度u=v=d/t=dleV/lVt

電泳的基本原理

在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。2.影響電泳速度的因素2.1電場強度泳動速度與電場強度成正比。常壓電泳(100—500V).2—10V/cm，幾小時或幾天；蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì);高壓電泳(500—1000V).20—200V/cm，幾分鐘；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物質(zhì).2.2溶液的pH值pH距待分離物質(zhì)的pI越遠，泳動速度越大2.3溶液離子強度離子強度越小,電動勢越大,泳動速度越快。2.4電滲現(xiàn)象：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。三.電泳技術(shù)分類原則上按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。電泳技術(shù)分類四.幾種常見電泳的比較類型優(yōu)點缺點紙電泳設備操作簡單分辨率差，電滲現(xiàn)象醋酸纖維薄膜電泳設備操作簡單，樣品用量少分辨率差瓊脂糖凝膠電泳快速，分辨率高電滲現(xiàn)象嚴重聚丙烯酰胺凝膠電泳可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無電滲現(xiàn)象高濃度凝膠難剝離五.電泳技術(shù)在藥物分析中的應用

藥典中的收載情況英國藥典：

1975年版開始將電泳收載入附錄,1980版、1993版將電泳方法增加到6種,1998年版又對自由移動界面電泳作了詳細說明美國藥典：

1985版起開始將電泳收載入附錄,并對凝膠電泳的原理、影響因素作了詳細的說明,NF22冊又增加了DESK電泳。中國藥典：

1990年版二部首次收載入附錄中，1995年版、2000年版、2005年版將電泳中的五種電泳技術(shù)(紙電泳法、醋酸纖維素薄膜電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法,聚丙烯酰胺凝膠電泳法、SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫電泳法在附錄中規(guī)定下來,并對高效毛細管電泳也作了詳細的說明。1.紙電泳法(paperelectrophoresis)紙電泳法：是用濾紙作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。特點：設備簡單,應用廣泛；電泳時間長,分辨率較差。應用：三磷酸腺苷二鈉原料、三磷酸腺苷二鈉注射液的含量的測定；胞磷膽堿鈉有關(guān)物質(zhì)檢查。此外，在植物化學成份的分離中得以應用,如糖類,三萜類等可利用其衍生物的方法使其分子帶電荷,再用紙電泳法進行分離。2醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳：是用醋酸纖維素薄膜作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。特點：電泳后區(qū)帶界限清晰,分辨力強；通電時間較短；對各種蛋白質(zhì)都幾乎完全不吸附，無拖尾現(xiàn)象；對染料也不吸附；電滲作用雖高但很均一,不影響樣品的分離效果,必須在密閉的容器中進行電泳,并使用較低壓電流避免蒸發(fā)。

應用：《中國藥典2005版三部》中人血白蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、破傷風人免疫球蛋白、2000版中人胎盤蛋白、人胎盤血免疫球蛋白中的蛋白質(zhì)純度測定。臨床檢驗中已經(jīng)廣泛用于血清蛋白,血紅蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,類固醇及同工酶、尿蛋白等的分離分析以及免疫電泳等中，用于疾病的診斷。3聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠電泳:

根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子大小、形狀的不同，在電場的作用下，產(chǎn)生不同的移動速度而分離的方法。特點：具有電泳和分子篩的雙重作用。重復性高,凝膠柱彈性好,無電滲作用,且設備簡單,樣品量少,分辨率高。應用：《中國藥典2005年版二部》中胰島素及中性胰島素注射液的有關(guān)蛋白質(zhì)檢查

此外，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳還用于性別基因鑒定。聚丙烯酰胺凝膠電泳法目前還廣泛應用于分子生物學、生物化學、細胞學、微生物學、植物學、動物學、免疫學等學科的研究以及臨床化驗。4.瓊脂糖電泳

瓊脂糖電泳：是用瓊脂糖作為電泳支持介質(zhì)的一種方法。一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，尤其適于分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達107bp的DNA片段。

應用：判斷擴增片斷的大?。换厥諗U增片斷，用于轉(zhuǎn)印進行Southern印跡用于中藥材的鑒別真?zhèn)?、分辨?yōu)劣，中藥材指紋圖譜的研究等。

5.免疫電泳免疫電泳：把電泳技術(shù)與免疫擴散結(jié)合起來，基于抗原的電泳遷移以及與抗體的專一性免疫沉淀反應。在大部分電泳中，樣品中的抗原通過含有相應抗體的pH8.6的薄層瓊脂糖凝膠，抗原在pH8.6時通常帶強負電，而抗體在此pH不帶電，不能遷移動?？乖诤锌贵w的凝膠中電泳時發(fā)生免疫反應。最初，抗原過量，所以僅產(chǎn)生可溶性的免疫混合物，與抗原一起向陽極移動，當抗體與抗原比例合適時就形成大的、不溶性的免疫沉淀。應用：中國藥典三部中：人血白蛋白及各類免疫球蛋白的鑒別實驗，均采用本方法。 可用于檢查蛋白質(zhì)制劑的純度，研究抗血清制劑中是否具有抗某種已知抗原的抗體，檢驗兩種抗原是否相同等。

6高效毛細管電泳法

(highperformancecapiaryelectrophoresis,HPCE)高效毛細管電泳法:根據(jù)離子在緩沖液中遷移的速度與電場呈正比原理,將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術(shù)溶為一體,是繼高效液相色譜法出現(xiàn)后分析科學領域的又一次革命。特點：“三高二少”，即具有高靈敏度、高效快速、高分辨率,用量少、成本低等優(yōu)點,可方便地連續(xù)洗脫樣品。HPCE的分類

毛細管區(qū)帶電泳（CZE）毛細管凝膠電泳（CGE）

膠束電動毛細管色譜（MEKC,

HPCE

MECC)