第十章 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與生物反應(yīng)器

第十章

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與生物反應(yīng)器10.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)

基因工程技術(shù)：按照人們的意愿，重組DNA（一種生物DNA中的遺傳密碼片段連接到另一種生物的DNA鏈上），設(shè)計(jì)新的遺傳物質(zhì)，創(chuàng)造新的物種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)：通過人工操作的方法將外源基因整合到生物體基因組內(nèi)，使該轉(zhuǎn)基因生物能穩(wěn)定地表達(dá)并將此基因遺傳給后代的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。10.1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因的方法

常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染（接受外源基因）的方法有兩種：1.

暫時(shí)轉(zhuǎn)染：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)不必停留很長時(shí)間，DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，翻譯成蛋白質(zhì)，并不進(jìn)入基因組。如磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)體載體發(fā)等。2.

永久性轉(zhuǎn)染：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法可產(chǎn)生永久有效的轉(zhuǎn)染。10.1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因的方法

基因轉(zhuǎn)移的方法：物理、化學(xué)和生物方法。一、物理方法1.電穿孔法：利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，在細(xì)胞膜上形成納米級的微孔。從而使外源DNA不經(jīng)過胞飲作用直接轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。2.微注射法：通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄鼠交配，處死雌鼠取出受精卵。借助顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入受精卵中變大的雄核內(nèi)，將受精卵移植到另外一只假受孕的母鼠的輸卵管內(nèi)，正常發(fā)育、繁殖出轉(zhuǎn)基因鼠。10.1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因的方法

3.裸露DNA直接注射法將裸露DNA直接注射到組織中，DNA有可能直接被細(xì)胞所攝入。最簡單，但效率低。二、化學(xué)方法生1、DEAE-葡聚糖法將外源DNA片段與DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合物混合，這樣DNA鏈上帶負(fù)電的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正電荷基團(tuán)上。2.磷酸鈣-DNA共沉淀法：磷酸緩沖液（pH7.1）溶解DNA，加氯化鈣，磷酸鈣與DNA共沉淀形成大顆粒。通過鈣、磷誘導(dǎo)細(xì)胞吞噬或脂相收縮的空隙，DNA進(jìn)入細(xì)胞。3.脂質(zhì)體載體包埋法：人工膜泡（載體）包裹DNA，與受體細(xì)胞融合。三、生物學(xué)方法：病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。常用的病毒載體包括DNA病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體可穩(wěn)定、長期表達(dá)外源基因。載體通常含有一個(gè)選擇性標(biāo)記和要表達(dá)的外源基因。由于病毒的大部分結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被除去，這種載體不能自我復(fù)制。將克隆的原病毒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞中產(chǎn)生病毒原種，病毒原種缺少復(fù)制功能，但能感染培養(yǎng)靶細(xì)胞，從而有效地誘導(dǎo)出重組基因組，即反轉(zhuǎn)錄出DNA，并插入細(xì)胞基因組中。但病毒載體有缺陷：所有病毒載體都會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一定程度的免疫反應(yīng)；或多或少存在安全隱患；轉(zhuǎn)導(dǎo)能力有限，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。10.1.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定

可設(shè)計(jì)含有抗藥性基因的外源DNA載體，然后通過選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選。也可通過提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA，以適當(dāng)限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行Southern轉(zhuǎn)移分析，檢驗(yàn)細(xì)胞中是否有被轉(zhuǎn)移的外源基因。10.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimal）：在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地表達(dá)和遺傳給后代的遺傳工程動(dòng)物。10.2.1發(fā)展歷史

1974年，賈英利斯和明茨應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次獲得AV40DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。1980年，戈登等人首次育成帶有人胸苷激酶基因的轉(zhuǎn)移小鼠。1982年，帕爾米特等人將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，獲得比普通對照小鼠生長速度快2~4倍、體形大一倍的轉(zhuǎn)基因“碩鼠”。隨后的幾十年里，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)飛速發(fā)展。10.2.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

一、原理與方法

生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)：外源目的基因制備；外源目的基因有效的導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞；選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞；選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定；篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系。10.2.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

方法：1.

原核期胚胎顯微注射法2.

反轉(zhuǎn)錄病毒感染法3.

胚胎干細(xì)胞方法4.

精子載體法：精子與DNA混培養(yǎng)，精子攜帶DNA進(jìn)入卵子5.

人工酵母染色體法：百萬堿基對的巨大基因，整合率較高6.

受精前卵細(xì)胞顯微注射法7.

其他方法：電脈沖法、染色體片段注入法、磷酸鈣共沉淀法、微彈轟擊法、基因剔除、基因嵌入等3種轉(zhuǎn)基因的方法及其與發(fā)育階段的關(guān)系：

DNA反轉(zhuǎn)錄病毒感染或DNA轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)移胚胎干細(xì)胞顯微注射囊胚受精卵四細(xì)胞期原腸胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物DNA顯微注射DNA反轉(zhuǎn)錄病毒感染轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定技術(shù)：早期采用的、也是目前最有權(quán)威性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定技術(shù)是Southernblot。提取待檢動(dòng)物組織的染色體消化后電脈，轉(zhuǎn)膜后選擇適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行雜交，通過放射自顯影獲得結(jié)果。

斑點(diǎn)雜交：提取動(dòng)物DNA，點(diǎn)于硝酸纖維素膜，探針雜交，放射自顯影。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析即可鑒定。

染色體原位雜交：（？）目的基因的制備目的基因的來源1.采用限制性內(nèi)切酶，從基因細(xì)胞中獲取目的基因2.通過mRNA合成cDNA3.人工體外合成DNA片段4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增特定基因片段目的基因的克隆1.通過載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦锌寺。?）基因克隆的載體載體的選擇與改造應(yīng)具備：提供在適當(dāng)宿主細(xì)胞中復(fù)制的信號(hào)，或能整合到宿主染色體上與基因組一起復(fù)制；有增殖非必須的DNA區(qū)域，并含單個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便外源DNA共價(jià)連接（插入或取代該區(qū)段），形成重組子可在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖；分子量不宜過大，以便于DNA體外操作；載體DNA易與宿主核酸分開，便于提純；具有篩選標(biāo)記，以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子，選擇標(biāo)記包括抗藥性基因、酶基因、營養(yǎng)缺陷型、形成噬菌斑的能力等。目的基因的克隆

（1）基因克隆的載體質(zhì)粒載體：質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制子，對細(xì)菌的某些代謝活動(dòng)和抗藥性表型有一定作用。λ噬菌體載體：λ噬菌體是一種雙鏈DNA噬菌體，基因組約有50kb，在λ噬菌體顆粒中分離出來的DNA為線性雙鏈分子，在分子兩端各有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈順序，是天然的粘性末端。

粘粒載體：由質(zhì)粒和噬菌體的粘性末端構(gòu)建而成。由于噬菌體載體容量仍受一定限制，最大插入片段不能超過23kb。粘粒載體：質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、1個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、抗藥性標(biāo)記、帶有粘性末端的DNA片段。大小4~6kb，插入2945kb。（2）目的基因與載體DNA間的連接1）粘端連接反應(yīng)方法

2）平斷連接反應(yīng)方法（3）重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞氯化鈣轉(zhuǎn)化法2.通過PCR反應(yīng)克隆目的細(xì)胞

在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。10.2.3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的意義與最新進(jìn)展

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的意義：1、建立人類疾病動(dòng)物模型；2、加速動(dòng)物育種；3、研究真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理；4、哺乳動(dòng)物特異組織系統(tǒng)生產(chǎn)人用藥用蛋白、細(xì)胞、組織、器官。10.2.3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的意義與最新進(jìn)展

優(yōu)良動(dòng)物育種：1.

快速生長與肉質(zhì)改善2.

抵抗疾病3.

增加羊毛產(chǎn)量和性能4.

抗凍品種培育10.2.3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的意義與最新進(jìn)展

在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用：1.

抗出血性藥物2.

抗凝血藥物3.血栓治療藥物4.肺氣腫治療藥物5