放線菌掃描電鏡樣品制備方法的篩選

放線菌掃描電鏡樣品制備方法的篩選

自從威爾遜和davius1成功使用掃描電鏡觀察和研究放線菌以來，科學(xué)官員對大量菌株進(jìn)行了檢測和觀察。改進(jìn)的樣品制備方法和機(jī)器操作方法，使樣品在高放大下具有更高的分辨率。通過對不同屬的菌體精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,獲取了一系列與形態(tài)相關(guān)的有用信息,使之一直作為區(qū)分和鑒定種屬的重要手段。放線菌樣品在掃描電鏡進(jìn)行觀察之前,一般都需采用固定、脫水、干燥及表面鍍金等處理［2］。但因放線菌這類微生物體積微小,不但收集菌體困難,而且在處理時大量樣品會流失,也不能保持微生物生長的自然狀態(tài)。如何避免制備過程中的失水、變形、丟失及損傷等問題是獲得滿意觀察結(jié)果的關(guān)鍵。從取材來源到處理方法,都將直接影響觀察效果,初學(xué)者很難把握。本文通過對放線菌鏈霉菌掃描電鏡觀察,對不同的取材來源、樣品處理方法進(jìn)行比較。同時,對簡便快速方法進(jìn)行嘗試,比較和總結(jié)影響放線菌掃描電鏡觀察結(jié)果的主要因素,篩選出簡便、合適的樣品制備方法進(jìn)行放線菌掃描電鏡觀察,獲得豐富滿意的觀察結(jié)果,同時為進(jìn)一步開發(fā)利用新的實(shí)驗(yàn)方法提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1scabrusporus135545445555555105105545451010101010101010.5.10.7.4.10.7.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4與16srrna序列的scablusporus鏈霉菌Bn035(Streptomycesscabrisporus),由本實(shí)驗(yàn)室新分離鑒定(16SrRNA序列Genbank登錄號為KC440853)、高氏1號培養(yǎng)基斜面4℃保存。1.1.2培養(yǎng)基和試劑PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯20g、葡萄糖2g、瓊脂1.5g、自來水100mL),PD培養(yǎng)基(不加瓊脂),10%重鉻酸鉀溶液,pH7.2磷酸緩沖液(PBS),3%戊二醛溶液,1%四氧化鋨溶液,0.85%生理鹽水。1.1.3熒光顯微鏡正置顯微鏡MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋,MyCycler580BR恒溫震蕩器,AIRTECHVS-1300L超凈工作臺,OlympuFSX100型正置熒光顯微鏡,EMITECHK-850型臨界點(diǎn)干燥儀,HitachiE-1010型離子濺射儀,TESCAN5136型掃描電子顯微鏡。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基pd培養(yǎng)基在無菌操作條件下,刮取斜面培養(yǎng)的鏈霉菌Bn035孢子少許,制成無菌懸液。取0.2mL加入含有20mLPD培養(yǎng)基的三角瓶中,180r/min30℃恒溫振蕩培養(yǎng)8d;同時取上述無菌懸液0.2mL,涂布于盛有PDA培養(yǎng)基的平皿中,用鑷子將滅菌的蓋玻片以45°夾角插入培養(yǎng)基內(nèi)(每皿3~4片),28℃恒溫培養(yǎng)8d和14d。1.2.2酵母粉添加量的培養(yǎng)將樣品直接用普通顯微鏡高倍鏡鏡檢,確定目標(biāo)的生長狀況。插片樣品用鑷子取已生長菌株孢子絲的蓋玻片,將蓋玻片進(jìn)行切割;菌餅樣品用打孔器在固體平皿孢子絲生長密集處打孔(直徑4mm);發(fā)酵液樣品:吸取培養(yǎng)好的發(fā)酵液0.2mL。將樣品分別放入含有3%戊二醛固定液的1.5mL離心管中固定24h,備用。1.2.3樣品處理方法對3種取材來源的待處理樣品分別采用不同固定方法和清洗溶液,對照CK是將樣品戊二醛和四氧化鋨雙重固定、PBS緩沖液清洗,乙醇梯度脫水,丙酮置換。各樣品具體處理方法見表1。全部處理樣品真空干燥后,用銀導(dǎo)電膠將樣品粘在樣品臺上,離子濺射儀鍍膜,掃描電子顯微鏡觀察并照相,加速電壓15kV。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)8d發(fā)酵液樣品電鏡觀察從圖1可以看出,培養(yǎng)14d的插片樣品和菌餅樣品及培養(yǎng)8d發(fā)酵液樣品,均可觀察到營養(yǎng)菌絲體、氣生菌絲體和孢子絲,孢子絲直生或螺旋狀,說明在此時期將樣品處理用做電鏡觀察適合。2.2分節(jié)細(xì)胞直徑測定結(jié)果在本試驗(yàn)中,分別取培養(yǎng)8d和14d的菌餅樣品處理觀察,結(jié)果表明菌絲體形態(tài)范圍有明顯區(qū)別。由圖2a(8d)顯示:在這個時期,該菌形態(tài)簡單,主要以營養(yǎng)菌絲體為主,菌絲直徑0.5μm左右;由圖2b(14d)顯示,樣品主要以未斷裂的孢子鏈為主,同時可發(fā)現(xiàn)螺旋孢子鏈,分節(jié)孢子直徑在0.5μm左右。與同樣培養(yǎng)14d的插片樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),插片樣品極易觀察到斷裂但未分散的孢子鏈(見圖2c)。而對于發(fā)酵液樣品圖2d(8d)進(jìn)行觀察,不易觀察到孢子鏈,孢子散落成片,單個孢子直徑都在0.5~1μm。從上述4種樣品掃描結(jié)果分析可知,若想獲得同一菌種的最佳觀察效果,必須準(zhǔn)確把握培養(yǎng)時間,對于鏈霉菌Bn035來說,發(fā)酵液獲得良好形態(tài)的菌體最快,平皿培養(yǎng)的插片樣品次之,平皿培養(yǎng)的菌餅樣品最慢。2.3菌種的生長形態(tài)插片樣品獲得的菌體圖像背景簡單,結(jié)構(gòu)清晰,層次分明,很少有雜物干擾;菌絲和孢子排列整齊,形態(tài)正常,分散度好,孢子鏈延展,帶有螺旋狀;孢子呈圓柱形,表面褶皺(見圖3a1,3a2)。菌餅樣品中菌絲和孢子堆砌在一起,相互交叉重疊;部分菌絲和孢子被培養(yǎng)基或分泌物覆蓋,要觀察的部位未充分暴露,但仍可少量觀察到未分節(jié)的氣生菌絲體、螺旋孢子鏈和散落的孢子(見圖3b1,3b2)。發(fā)酵液獲得的菌體,真實(shí)地展現(xiàn)了菌絲自然生長的形態(tài)結(jié)構(gòu),大量單個孢子附著在菌絲上,或散落在培養(yǎng)基上,呈橢圓形,光澤、飽滿、充滿活力,立體感強(qiáng);但無明顯孢子鏈,菌絲表面有大量附著物(見圖3c1,3c2)。2.4菌餅樣品的測定在圖4中,經(jīng)戊二醛和四氧化鋨雙重固定的菌餅樣品與戊二醛單固定、未經(jīng)任何固定處理直接干燥噴金的菌餅樣品比較,雙固定和單固定樣品無明顯差異,均能真實(shí)、完整地反映樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu),菌絲飽滿,表面光滑,無明顯皺縮和變形(見圖4a,4b);未經(jīng)任何固定處理直接干燥噴金的菌餅樣品孢子鏈明顯,但有部分菌絲和孢子皺縮變形(見圖4c)。2.5發(fā)酵液樣品的清洗由圖5可知,菌餅樣品在不同清洗方法處理后有明顯差異,用生理鹽水清洗后,有部分樣品被埋沒(見圖5b1~5b3)。發(fā)酵液樣品通過不同清洗方法處理,生理鹽水清洗后的孢子表面干凈、光滑,PBS和蒸餾水清洗的樣品在干燥后,菌絲和孢子周圍有分泌物(見圖5c1~5c3)。插片樣品在固定后,通過磷酸緩沖液、生理鹽水或蒸餾水清洗的樣品,孢子表面無明顯差異(見圖5a1~5a3)。2.6發(fā)酵液樣品測定在圖6中,菌餅樣品的菌絲和孢子經(jīng)乙醇或丙酮脫水,孢子皺縮明顯(見圖6a1,6a2)。發(fā)酵液樣品經(jīng)乙醇或丙酮脫水,結(jié)果無明顯區(qū)別,菌絲和孢子光滑、飽滿(見圖6b1,6b2)。插片樣品經(jīng)乙醇或丙酮脫水,菌絲和孢子表面無明顯皺縮(見圖6c1,6c2)。3不同分析方法對于樣品制備的影響Tresner等［3］利用電子顯微鏡鑒別鏈霉菌菌種,以孢子鏈的形態(tài)、孢子表面結(jié)構(gòu)、孢子囊形狀、單個孢子的構(gòu)成、孢子表面的裝飾物如光滑、凸起、褶皺、多刺等作為區(qū)別特征,這些特征即使在今天的放線菌分類學(xué)中也仍然十分重要。因此,孢子表面的裝飾物是一種重要的分類學(xué)特征,觀察到這種特征的變化以及孢子鏈的形態(tài)對于區(qū)分鏈霉菌屬內(nèi)各個種是很重要的［4］。掃描電鏡觀察需要各種形態(tài)的菌絲和孢子,而拍攝這類照片,樣品制備是關(guān)鍵。本研究通過對不同取材來源和不同處理方式的樣品進(jìn)行觀察,其結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):通過合適的培養(yǎng)時間和取樣方法才容易在一個樣品中觀察到各主要時期整體孢子鏈的豐富形態(tài)細(xì)節(jié)。另外,先在光鏡下選取菌絲分散、孢子絲多的樣品進(jìn)行固定,節(jié)省了時間,觀察效果好。目前,掃描電鏡樣品制備過程從固定到濺射鍍膜要花掉一整天時間,并且需要先進(jìn)的技術(shù)及專業(yè)知識,給放線菌電鏡樣品制備增加了一定的困難。本研究與常規(guī)掃描電鏡制樣方法比較,探究不同固定、清洗和脫水處理過程對放線菌掃描觀察結(jié)果產(chǎn)生何種影響,結(jié)果表明不同固定、清洗、脫水處理過程影響了樣品照片的清晰度和菌體數(shù)量。有研究報道蒸餾水、PBS滴在玻片上,干燥后蒸餾水無雜質(zhì)殘留,PBS干燥后留下了顆粒層;用水清洗樣品后無雜質(zhì)覆蓋;用戊二醛固定后不清洗,干燥后有留下一層細(xì)微顆粒膜覆蓋遮蔽樣品［5，6］,與本研究結(jié)果一致。因此,結(jié)合本研究結(jié)果,建議樣品如果經(jīng)過固定后,要用蒸餾水或乙醇、丙酮等干燥后無殘留的試劑清洗,但乙醇、丙酮會使樣品收縮,用蒸餾水清洗經(jīng)濟(jì)又方便。另有文獻(xiàn)報道［7］,在放線菌制樣過程中不固定,省去清洗和脫