利用游離態(tài)金屬離子測定螯合物有效螯合率

利用游離態(tài)金屬離子測定螯合物有效螯合率

有機微標簽是指通過配置鍵形成的化合物，即有機及其分解的產(chǎn)物與貧化物有關(guān)。目前國內(nèi)外市場上已有眾多此類產(chǎn)品在生產(chǎn)銷售,作為一種新型微量元素添加劑使用。相比于無機微量元素,有極微量元素螯合物具有抗干擾力強、穩(wěn)定性好、吸收率高、生物效價高、毒性小等眾多優(yōu)點。有機微量元素產(chǎn)品也面臨著一個問題,就是如何快速和準確的測定產(chǎn)品中絡(luò)合或螯合態(tài)金屬所占的比例,以及已經(jīng)絡(luò)合或螯合部分金屬的穩(wěn)定程度。關(guān)于絡(luò)合率檢測方法,以前的研究工作中多采用有機溶劑萃取、電化學(xué)分析等方法,如甲醇提取法、離子選擇性電極法、氧化還原電位滴定法、濃差電位法等測定絡(luò)合體系的絡(luò)合率。雖然上述方法可以將不同形態(tài)的金屬離子分離,但是這樣的區(qū)分僅是人為的假定已將螯合態(tài)和游離態(tài)完全區(qū)分開來。在實際條件下由于所用螯合劑、螯合工藝等不同生產(chǎn)出來的螯合物其穩(wěn)定性也有很大差異,使得分離方法很難統(tǒng)一;另外即使相同的螯合物在采用不同的分離方法進行分離時所得到的結(jié)果會有很大的差異,難以衡量方法的優(yōu)劣,也無法確定經(jīng)分離得到的螯合態(tài)金屬離子是否完全,因此,所測定的結(jié)果一般都有比較大誤差。鑒于現(xiàn)有的這些檢測方法均不同程度存在著諸如分離不完全、準確度差、局限性大的問題,本文旨在建立一種重現(xiàn)性較好、能真實反應(yīng)有效成分含量的螯合率測定方法。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1緩沖劑、絡(luò)黑t指示劑、鋅標準溶液的配制實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中二級用水的規(guī)格,所用試劑除特殊規(guī)定外,均為分析純。復(fù)合肽:豆粕經(jīng)芽孢桿菌發(fā)酵水解,從得到的多肽液中分離出分子量10000Da以下的部分,再經(jīng)噴霧干燥而得到的干粉;復(fù)合肽螯合鋅:復(fù)合肽與ZnCl2在一定條件下反應(yīng)再經(jīng)噴霧干燥得到的干粉;pH10.0NH3-NH4Cl緩沖液:54gNH4Cl加水溶解,再加入350mL濃氨水定容止1000mL;pH9.0Clark-lubs緩沖液[C(H3BO3)=0.05mol/L]:氫氧化鈉0.832g,硼酸3.092g,氯化鉀1.864g,加水溶解后定容至1000mL;pH2.0HCl溶液:0.01mol/L的鹽酸溶液;乙二胺四乙酸二鈉溶液[C(EDTA-2Na)=0.01mol/L]:3.722g乙二胺四乙酸二鈉加水溶解定容至1000mL;氫氧化鈉溶液[C(NaOH)=10mol/L]:40gNaOH加水溶解定容至100mL;鹽酸溶液[C(HCl)=6mol/L]:濃鹽酸與水1∶1混合;PAN指示劑[0.5%,m/V]:0.5gPAN[1-(2-吡啶偶氮)-2萘酚]加無水乙醇100mL溶解;絡(luò)黑T指示劑[0.5%,m/V]:0.5g落黑T加水100mL溶解;藍色葡聚糖2000[0.5%,m/V]:50mg藍色葡聚糖2000加水10mL溶解;鋅標準溶液:1.000g/L;ZnO:ARSephadexG-151.1.2u3000酸、電、混合儀色譜柱:200mm×16mm;普通離心機:轉(zhuǎn)速能達到5000r/min;酸式滴定管:25mL,0.1mL;精密pH計:精確度0.01;電子天平:精確度0.001g;1mL及200μL移液器;旋渦混合儀;40mL離心管、250mL三角瓶、100mL及500mL容量瓶1.2實驗操作的基本步驟1.2.1凝膠柱的均勻性檢驗取約20g的SephadexG-15經(jīng)活化處理后裝入200mm×16mm的色譜柱,裝柱時控制凝膠部分高度在15cm左右,即柱床體積在30mL左右,柱上端留一截空隙以便加樣。凝膠裝填好后加入0.2mL藍色葡聚糖2000溶液,用純水洗脫以檢測凝膠柱的均勻性,確認凝膠裝填均勻且沒有氣泡后用水平衡35倍柱床體積。洗脫時,控制流速在3mL/min左右。1.2.2稱取樣品0.20.5g，準確至0.001g，放入40ml離心管中，加水約24ml，充分混合，充分混合，稱取相應(yīng)所需ph，再混合至25ml，稱溶液為a溶液。將a溶液與5000r.min離心10分鐘后，小心地倒入上清液中，并將濃氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性，然后定容后使用，稱為溶液b溶液1.2.3金屬離子檢測凝膠柱經(jīng)堿性洗脫液平衡好后,排出洗脫液至凝膠表面近于流干,關(guān)閉出口開關(guān),根據(jù)樣品中金屬離子的大致濃度吸取15mLB液離凝膠表面約1mm小心加入,使之均勻滲入凝膠表面,用少量堿性洗脫液小心洗滌柱壁周圍及殘留在凝膠表面的樣品。1.2.4游離態(tài)金屬離子分離當將樣品加入到葡聚糖凝膠色譜柱內(nèi)并用堿性緩沖液洗脫時,游離金屬離子則會在此堿性pH條件下形成氫氧化物沉淀并固定在凝膠柱上端無法洗脫,而螯合態(tài)的金屬元素則可通過配體多肽、小肽以及氨基酸的攜帶從凝膠柱上洗脫下來,得以收集;待螯合態(tài)的金屬元素得到充分洗脫后,再換用酸性洗脫液洗脫,此時之前被固定在凝膠柱上的氫氧化物沉淀溶解,并得以洗脫。由此就可以實現(xiàn)螯合態(tài)和非螯合態(tài)金屬元素的分離。試驗中先用堿性洗脫液洗脫,收集洗脫液90100mL,并定容至100mL,得可溶性螯合金屬元素溶液,稱此溶液為C液;再換用酸性洗脫液洗脫,收集洗脫液80100mL,并定容至100mL,得游離態(tài)金屬離子溶液,稱此溶液為D液。洗脫結(jié)束后用堿性洗脫液平衡凝膠柱至流出的洗脫液pH達到堿性洗脫液pH。1.2.5edta絡(luò)合滴定法對于各組分中金屬含量的測定,通常采用原子吸收光譜法,該方法測定結(jié)果精確可靠,靈敏度高、適用測定的金屬元素范圍廣,但儀器較為昂貴,配套設(shè)施要求較多,條件要求較為苛刻,一般不太容易實現(xiàn)。當被測樣品中金屬元素含量不是很低且種類單一時,EDTA絡(luò)合滴定法也可準確測定金屬含量。此法應(yīng)用較為普遍,其原理是EDTA與二價金屬離子的絡(luò)合物(EDTA-M)的穩(wěn)定常數(shù)(lgK一般在18.8左右)遠大于氨基酸、小肽、絡(luò)黑T等有機物與金屬形成的絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)(lgK一般在410之間),因此可以用EDTA絡(luò)合滴定法直接測定有機微量元素螯合物以及分離得到的各樣品中金屬元素的含量。該方法在操作過程中不僅簡單快捷,而且對條件要求低、便于實現(xiàn)。本實驗所用的復(fù)合肽螯合鋅樣品中金屬元素種類單一而且含量較高,因此完全可使用EDTA絡(luò)合滴定法來測定試驗中各組分的金屬含量。具體測定方法為:分別取適量的A液、B液、C液、D液,各加入10mLpH10.0的NH3-NH4Cl緩沖液以及0.2mL的絡(luò)黑T指示劑,用濃度約為0.01mol/L的EDTA-2Na溶液滴定至溶液顏色由紫紅色剛剛變?yōu)榧兯{色(EDTA-2Na的準確濃度可通過鋅的標準溶液標定),記錄各自消耗EDTA-2Na溶液的體積。1.2.6計算結(jié)果(1)堿洗率：堿性洗脫液中的金屬元素占上樣總金屬含量的比例堿洗比例=VcVb?V0VB×100%=VcVb?V0VB×100%(2)洗衣粉比例：酸性洗滌劑溶液中的金屬元素占上述樣品總金屬含量的比例酸洗比例=VcV??V0VB×100%=VcV??V0VB×100%(3)vac0vbv0100%螯合率=(1?V??C0Va?C0?VBV0)×100%=(1?V?Va?VBV0)×100%螯合率=(1-V??C0Va?C0?VBV0)×100%=(1-V?Va?VBV0)×100%其中Va:A液消耗EDTA-2Na的體積;Vb:B液消耗EDTA-2Na的體積;Vc:C液消耗EDTA-2Na的體積;Vd:D液消耗EDTA-2Na的體積;VB:B液的體積;V0:上柱時所取B液的體積;C0:EDTA-2Na的濃度結(jié)果以三次平行測定結(jié)果平均值表示,保留2位小數(shù)。1.3堿洗脫液、ph的選擇1.3.1酸緩沖液及洗脫溶液ph該洗脫液首先應(yīng)該是不與被分離物質(zhì)反應(yīng)的惰性水溶液,其次,因為要求樣品中的非螯合態(tài)金屬元素在洗脫時形成氫氧化物沉淀,因此洗脫液必須呈堿性。磷酸鹽緩沖液中的PO43-在堿性條件下能與多種金屬離子形成磷酸鹽沉淀,Tris-HCl緩沖液在堿性條件下能夠使氫氧化物沉淀溶解,因此都不可取。本實驗選用Clark-lubs緩沖液即硼酸-氫氧化鈉-氯化鉀組成的緩沖體系。所用緩沖液必須能夠使樣品中的非螯合態(tài)金屬完全沉淀(完全沉淀是指相應(yīng)離子濃度小于10-5mol/L),因此需要有一個合適的pH。本實驗中選擇了從7.0到10.0的不同pH值的Clark-lbus緩沖液進行洗脫實驗。在選擇堿性洗脫液時,酸性洗脫液用pH2.0的HCl溶液。試驗中選用ZnO(0.1g)、ZnO+復(fù)合肽粉(ZnO0.1g,復(fù)合肽粉0.5g)、復(fù)合肽螯合鋅(0.5g)三種試樣來進行試驗,試樣按照“1.2.2樣品的制備”中所述的步驟來處理,其中A液所調(diào)pH為3.0,在此pH下ZnO是可以完全溶解的。1.3.2稀鹽酸溶液酸性洗脫液的目的是將固定在凝膠柱內(nèi)的氫氧化物沉淀溶解并洗脫下來且不對后續(xù)的檢測造成干擾即可,本實驗選用pH1.04.0的稀鹽酸溶液作為酸性洗脫液進行試驗。在選擇酸性洗脫液時,堿性洗脫液用pH9.0的Clark-lubs緩沖液。試驗中選用ZnO(0.1g)、ZnO+復(fù)合肽粉(ZnO0.1g,復(fù)合肽粉0.5g)、復(fù)合肽螯合鋅(0.5g)三種試樣來進行試驗,試樣按照“1.2.2樣品的制備”中所述的步驟來處理,其中A液所調(diào)pH為3.0。1.4動物體胃內(nèi)酸性環(huán)境的金屬元素的分離有機微量元素在被動物攝入到體內(nèi)之后是經(jīng)由小腸吸收的,而在其到達小腸之前需經(jīng)過胃的消化處理,動物胃內(nèi)處于一個酸性的環(huán)境,在進食后pH值一般在2.64.0之間,小腸內(nèi)的pH接近中性,一般在6.57.3之間。有機微量元素在不同的pH條件下穩(wěn)定性不同,當處于動物體胃內(nèi)酸性環(huán)境時,一部分與配體結(jié)合不緊密的金屬元素就會發(fā)生解離,和無機態(tài)的金屬元素一樣以離子狀態(tài)存在,這些游離金屬離子再與周圍的其他配體如磷酸、植酸、草酸等結(jié)合,就會生成不易被腸道消化吸收的的絡(luò)合物,只有那一部分經(jīng)過動物胃內(nèi)較低酸性環(huán)境消化處理再到達腸道內(nèi)中性環(huán)境之后任為為螯合狀態(tài)的才能視為有效成分。因此在處于動物體胃內(nèi)酸性環(huán)境時與配體結(jié)合不緊密的那一部分金屬元素實際上也是與無機態(tài)的金屬元素沒有任何區(qū)別的,在測定過程中需要加以分離。試驗中選用ZnO(0.1g)、ZnO+復(fù)合肽粉(ZnO0.1g,復(fù)合肽粉0.5g)、復(fù)合肽螯合鋅(0.5g)三種試樣來進行試驗,洗脫液根據(jù)“1.3”得出的結(jié)果確定,試樣按照“1.2.2樣品的制備”中所述的步驟來處理,其中A液所調(diào)pH范圍為2.06.0,即樣品制備時溶解pH的選擇范圍是2.06.0。1.5標準方法及標準取三種不同鋅含量的復(fù)合肽螯合鋅,按照“1.2.2樣品的制備”中所述的步驟及“1.3”、“1.4”得出的結(jié)果進行實驗測定螯合率,每個樣品平行測定6次,計算測定結(jié)果的標準偏差及變異系數(shù)。1.6螯合鋅試樣的檢測本實驗中選擇ZnO(0.1g)、ZnO+復(fù)合肽粉(ZnO0.1g,復(fù)合肽粉0.5g)以及三種不同鋅含量的復(fù)合肽螯合鋅(0.5g)5種試樣分別按照甲醇提取法、一般凝膠色普法(樣品加水溶解時不調(diào)節(jié)pH)和本實所建立的凝膠過濾色譜絡(luò)合滴定法進行螯合率的測定。2結(jié)果與分析2.1ph檢查和堿洗脫液的選擇2.1.1堿洗脫液phpH7.010.0的堿性Clark-lubs緩沖液對不同試樣的洗脫效果見表1:從表1可看出當堿性洗脫液pH小于等于8.5時,ZnO組的堿洗比例不為0,同時,ZnO+復(fù)合肽粉組和復(fù)合肽螯合鋅組的堿洗比例也要大于當堿性洗脫液pH大于8.5的時候,說明當堿性洗脫液pH低于等于8.5時游離的Zn2+不能得到充分的沉淀,部分會被洗脫出來,導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差;當堿性洗脫液pH大于8.5時,ZnO組游離Zn2+得到完全沉淀,ZnO+復(fù)合肽粉組和復(fù)合肽螯合鋅組的堿性洗脫的結(jié)果都比較穩(wěn)定。綜上可知,堿性洗脫液pH最低為9.0。若堿性洗脫液pH值過高,會加大酸洗的難度,綜合考慮,本實驗選擇pH9.0的Clark-lubs緩沖液作為堿性洗脫液。2.1.2酸性洗脫phpH1.04.0的酸性洗脫液對不同試樣的洗脫效果見表2:從表2中可看出當酸性洗脫液pH大于等于3.5時,各組的酸洗+堿洗比例均小于100%,說明有部分沉淀未能得到充分溶解洗脫仍殘留在凝膠柱內(nèi),導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差;當pH低于3.5時,沉淀的即可得到充分洗脫。據(jù)此可知,酸性洗脫液的pH必須要低于3.0。為了保證凝膠柱內(nèi)的金屬沉淀的徹底洗脫,酸性洗脫液可以偏低一些,但又為了便于堿性洗脫液對凝膠柱的平衡,酸性洗脫液pH不宜過低,綜合考慮,選擇2.0比較合適。2.2堿洗比例的變化樣品經(jīng)不同pH溶解處理后的測定結(jié)果見表3:從表3可知:(1)當溶液所調(diào)pH在6.0以下時,ZnO組中的鋅元素已完全處于溶解狀態(tài);而ZnO+復(fù)合肽粉組和復(fù)合肽螯合鋅組中的鋅元素隨著pH的下降溶解比例逐漸增大,其中ZnO+復(fù)合肽粉組中的鋅元素在pH下降到4.0后已經(jīng)完全溶解;(2)ZnO+復(fù)合肽粉組的堿洗比例隨著pH的下降也逐漸下降,而且下降趨勢呈現(xiàn)加大之勢,尤其是在pH4.0以下的時候,說明在酸的作用下,鋅與復(fù)合肽在溶液中不緊密結(jié)合所形成的絡(luò)合物發(fā)生了解離;(3)復(fù)合肽螯合鋅組的堿洗比例雖然也是隨著pH的下降逐漸下降,但是下降的并不是很多,而且下降的趨勢沒有ZnO+復(fù)合肽粉組的