核酸分子雜交技術(shù)-11-04

核酸分子雜交技術(shù)嚴(yán)永敏細(xì)胞與分子診斷系1目錄根本原理核酸探針核酸分子雜交技術(shù)2變性在熱、酸堿或變性劑作用下，DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，解離為兩條單鏈DNA的現(xiàn)象稱為變性。變性的特征生物學(xué)活性喪失,增色效應(yīng)核酸的變性與復(fù)性3磷酸二酯鍵

DNA和RNA的一級結(jié)構(gòu)4DNA解鏈曲線增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)

核酸分子加熱變性時(shí)，其在260nm處的紫外吸收急劇增加的現(xiàn)象。Tm值：當(dāng)紫外吸收變化到達(dá)最大變化的半數(shù)值時(shí)，此時(shí)所對應(yīng)的溫度稱為熔解溫度〔Tm〕、變性溫度或中點(diǎn)解鏈溫度。5分子雜交當(dāng)兩條不同來源的單鏈核酸分子DNA-RNA或DNA-DNA鏈之間存在互補(bǔ)的堿基序列時(shí)，通過堿基互補(bǔ)配對形成雙鏈雜交體的過程，稱為分子雜交〔molecularhybridization〕。分子雜交圖89概念：用同位素或其他化學(xué)方法標(biāo)記的與待測靶核苷酸序列互補(bǔ)雜交的核酸片段〔DNA或RNA〕。用途：檢測待檢核酸樣品中的特定基因序列。(DNA-DNA;DNA-RNA;RNA-RNA)要求：特異性，來源方便第二節(jié)核酸探針10

hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC111)基因組DNA探針；2)cDNA探針；3)RNA探針；核酸探針的類型：4)寡核苷酸探針。12〔一〕基因組DNA探針1.來源：這類探針來源于某種生物的基因組多為某一基因的全部或局部序列。2.制備方法:〔1〕基因克隆的方法〔2〕聚合酶鏈反響(PCR)

133.特點(diǎn):〔1〕多克隆在載體中的DNA片段，可以無限繁殖，取之不盡?！?〕相對RNA而言，DNA探針不易降解，標(biāo)記方法也較成熟。14〔二〕cDNA探針1.制備:cDNA文庫中篩選。2.特點(diǎn):不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達(dá)的研究。15〔三〕RNA探針特點(diǎn)：1〕單鏈探針，效率高，靈敏度高；2〕RNA/RNA、RNA/DNA更穩(wěn)定，特異性高；3〕不穩(wěn)定，易降解。16〔四〕寡核苷酸探針特點(diǎn):◆根據(jù)需要來合成相應(yīng)的核酸序列，防止天然探針的缺點(diǎn)；◆大多數(shù)長度一般為20～50bp；◆由于探針的長度較短，特異性較低，雜交信號較弱17常用的探針標(biāo)記物：

放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。核酸探針的標(biāo)記特點(diǎn):◆靈敏度高，特異性高；◆檢出限：1~10ug；◆環(huán)境污染，半衰期短。18常用放射性核素的物理性質(zhì)αβγ非放射性19FITC異硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基羅達(dá)明人染色體不同熒光素染色結(jié)果

非放射性同位素：熒光染料、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。20缺口平移標(biāo)記法示意圖酶促法1.缺口平移法〔nicktranslation〕探針標(biāo)記方法:212．隨機(jī)引物法(randompriming)人工合成6~8bp各種不同排列順序混合物引物在DNA聚合酶作用下，合成與探針DNA互補(bǔ)的DNA鏈，當(dāng)在反響液中參加一種被標(biāo)記dNTP時(shí)，即可形成標(biāo)記的DNA探針，但探針DNA序列是長短不等的。優(yōu)點(diǎn)：比活度高，結(jié)果穩(wěn)定22隨機(jī)引物標(biāo)記法示意圖233．DNA探針的末端標(biāo)記

〔1〕Klenow大片段的末端標(biāo)記法323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段

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Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶24利用KlenowDNA聚合酶標(biāo)記3’-端DNA探針

25〔2〕多核苷酸激酶標(biāo)記法〔polynucleofidekinase，PNK)多核苷酸激酶標(biāo)記法示意圖*不能進(jìn)行非放射性標(biāo)記26DNA半抗原標(biāo)記探針的檢測顯色系統(tǒng)：堿性磷酸酶——————NBT辣根過氧化物酶————DAB底物非放射性探針的檢測四唑硝基藍(lán)二氨基聯(lián)苯胺27制備特異性探針?biāo)枰母緱l件1.被檢基因結(jié)構(gòu)清楚；2.有明確的基因產(chǎn)物;3.某一基因產(chǎn)物；

具備以上條件之一就可以制備特異性基因探針。28第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)雜交類型檢測目的及范圍Southern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子菌落雜交檢測固定在膜上，經(jīng)裂解從細(xì)菌體釋放的DNA分子斑點(diǎn)雜交檢測固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子29PaperTowels1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin一、Southern印跡雜交

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毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖電轉(zhuǎn)移示意圖31

Northern印跡雜交流程圖二、Northern印跡雜交32Southern雜交結(jié)果Northern雜交結(jié)果33基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測

Western印跡法蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質(zhì)與標(biāo)記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達(dá)量。優(yōu)點(diǎn):分辨率高(1~5ng);特異;簡便;穩(wěn)定34準(zhǔn)備PAGE膠樣品的制備加樣SDS(蛋白先定量)蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移