超聲波提取敗醬草總黃酮工藝優(yōu)化

超聲波提取敗醬草總黃酮工藝優(yōu)化

失敗綜合征，也稱為澤珍和苦草，屬于晚火科多年生草本植物。敗醬草是我國常用中草藥,具有清熱解毒之功效,野生敗醬草廣泛存在于自然界,研究表明,敗醬草含有較高的黃酮、皂苷等活性物質(zhì),敗醬草葉粗提物具有明顯的抗氧化、抗腫瘤及抗菌等藥理功效;研究發(fā)現(xiàn)敗醬草具有極高的營養(yǎng)價(jià)值,含有豐富的維生素、氨基酸和礦物質(zhì),在我國的許多地方被作為野生蔬菜食用,由此可見敗醬草不僅是一個(gè)安全性高的中藥材而且還是一較好的天然抗氧化劑。大量研究表明,黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗過敏、抗炎癥等多種生理活性及藥理作用,且無毒副作用。黃酮類化合物具有抗氧化的效果,可減少自由基對人體的傷害。目前對敗醬草的研究還不夠深入,對其中黃酮類化合物的研究也不夠豐富,沒有使這一中草藥的價(jià)值得到最大的發(fā)揮。因此研究敗醬草中的黃酮類化合物具有較大的實(shí)際意義。本研究對敗醬草中總黃酮的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,對不同部位、不同采集時(shí)期的敗醬草中總黃酮含量進(jìn)行了測定,旨在確定敗醬草中總黃酮的最佳提取工藝條件和最佳采集時(shí)期及應(yīng)用部位,為敗醬草的綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1白色雜草敗醬草老葉購自藥店,產(chǎn)地遼寧,敗醬嫩葉和根自當(dāng)?shù)匾巴獠杉?.1.2試劑蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心,無水乙醇、硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、苯酚均為分析純,去離子水。1.1.3儀器雙光束紫外可見分光光度計(jì),722N可見分光光度計(jì),高速離心機(jī),101B-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱,超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。1.2方法1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品200mg,用70%乙醇定容到100mL容量瓶中,放冷,精密吸取5.0mL,置于50mL容量瓶內(nèi),用水稀釋至刻度,得0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0、2、4、6、8、10mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液至25mL容量瓶中,加30%的乙醇溶液至10mL,加入5%的亞硝酸鈉溶液0.7mL,搖勻,靜置5min,再加入5%的硝酸鋁溶液0.7mL,搖勻,靜置5min,加入1mol/mL的氫氧化鈉溶液5.0mL,最后用30%乙醇溶液定容到刻度線,搖勻,靜置5min后,在最大吸收峰處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(C)為橫坐標(biāo),所測吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用線性回歸的方法,求回歸方程。1.2.2敗醬草中黃酮類物質(zhì)的提取敗醬草用去離子水洗凈后自然陰干,粉碎,過40目篩,脫脂烘干后,乙醇回流法提取,準(zhǔn)確稱取4g敗醬草加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,浸提黃酮類物質(zhì)。1.2.3總黃酮含量的測定采用硝酸鋁顯色法,以蘆丁為標(biāo)樣,在510nm處測定其吸光度,測定總黃酮的含量。吸取提取液0.5mL,置于25mL容量瓶內(nèi),加入5%的亞硝酸鈉0.7mL,搖勻后靜置5min,加入10%的硝酸鋁0.7mL,搖勻后靜置5min,再加入1mol/mL的氫氧化鈉5mL,用30%的乙醇溶液定容至25mL,靜置5min后在510nm處測定其吸光度,參比為不含提取液的空白試劑,根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程即可知提取液中總黃酮含量。1.2.4單因素試驗(yàn)分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比(W/V,g∶mL,下同)、提取時(shí)間對敗醬草總黃酮含量的影響。1.2.5因素與水平的確定根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定以提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),因素與水平見表1,優(yōu)化敗醬草中總黃酮的提取工藝。2結(jié)果與分析2.1標(biāo)準(zhǔn)的甘蔗曲線吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為A贊=10.1430C+0.0056,r=0.9992(圖1)。2.2單因素試驗(yàn)2.2.1提取時(shí)間對敗醬草總黃酮提取率的影響在提取溫度為70℃,料液比為1∶20,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下,研究提取時(shí)間對敗醬草總黃酮提取率的影響(圖2)。結(jié)果表明,隨著提取時(shí)間的增加,總黃酮的提取率也逐漸增加,提取2.0h時(shí)達(dá)到最大值,然后提取率逐漸下降,因此,選擇2.0h為總黃酮提取的最佳提取時(shí)間。2.2.2提取溫度對敗醬草總黃酮提取率的影響在提取時(shí)間為2.0h,料液比為1∶20,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下,研究提取溫度對敗醬草總黃酮提取率的影響(圖3)。結(jié)果表明,在一定溫度范圍內(nèi),總黃酮的提取率隨著溫度的升高而增加,溫度超過70℃時(shí),總黃酮得率增幅放緩,總黃酮提取時(shí)要防止溫度過高而引起化合物的分解,因此,最適溫度設(shè)為60～80℃。2.2.3料液比對敗醬草總黃酮含量的影響在提取時(shí)間為2.0h,提取溫度為70℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下,研究料液比對敗醬草總黃酮含量的影響(圖4)。結(jié)果表明,隨著溶劑量的增加,總黃酮含量明顯增加,在料液比為1∶20后趨于穩(wěn)定,當(dāng)黃酮類物質(zhì)完全溶出后,即使繼續(xù)加大溶劑的量,總黃酮含量基本趨于穩(wěn)定。綜合考慮,最適料液比設(shè)為1∶20。2.2.4響應(yīng)面圖2在提取時(shí)間為2.0h,提取溫度為70℃,料液比為1∶20時(shí),研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對敗醬草總黃酮提取率的影響(圖5)。結(jié)果表明,在乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%的乙醇溶液中,總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加,超過60%后,總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加為減少,這是由于敗醬草黃酮類物質(zhì)種類很多,不同種類黃酮極性不同,按相似相溶原理,在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí),溶液極性有利于大多數(shù)黃酮類物質(zhì)溶解。因此,最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。2.3黃酮提取率的測定結(jié)果采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行敗醬草總黃酮提取,確定總黃酮最佳提取條件,試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知,各因素對總黃酮提取率的影響主次順序?yàn)?A=C>B>D。根據(jù)正交試驗(yàn)可以確定敗醬草中總黃酮最佳提取工藝條件為A2B1C2D2即提取時(shí)間為2.0h,提取溫度為60℃,料液比為1∶20,乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。2.4敗醬草總黃酮含量的測定根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果,在敗醬草中總黃酮最佳提取條件下對敗醬草嫩葉和根中總黃酮分別進(jìn)行提取,結(jié)果見圖6,由圖6可以看出,敗醬草不同部位總黃酮含量變化規(guī)律為:嫩葉>老葉>根。2.5總黃酮含量的測定根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果,使用超聲波輔助提取,超聲波外接水浴鍋保證提取溫度,提取時(shí)間為30min,后續(xù)提取時(shí)間縮短30min,以維持總的提取時(shí)間不變,然后進(jìn)行總黃酮含量的測定,結(jié)果見圖7。測得總黃酮含量分別為:嫩葉2.13%,根1.68%,老葉1.86%。由結(jié)果可以看出,超聲波破壁有利于總黃酮的提取。3超聲波輔助選擇敗醬草中總黃酮類物質(zhì)試驗(yàn)研究了敗醬草中總黃酮的最優(yōu)提取條件。通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件:提取時(shí)間2.0h,提取溫度60℃,料液比1∶20,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。測得總黃酮的含量為老葉1.75%,嫩葉2.04%,根1.59%?？梢钥闯?不同部位或不同采摘時(shí)間,敗醬草中總黃酮的含量有所差異,其總的變化規(guī)律為:嫩葉>老葉>根,因此,對敗醬草的開發(fā)利用,嫩葉的價(jià)值更高。引入超聲波提取后,則總黃酮含量為老葉1.86%,嫩葉2.13%,根1.68%,不管是那一部位,何時(shí)采摘,超聲波