第五章 藥用植物分子鑒定

第五章藥用植物分子鑒定

試講人：田恩偉科室：藥植與中藥鑒定教研室MolecularIdentificationofMedicinalPlants中藥材市場假藥多教學(xué)內(nèi)容1.了解遺傳標(biāo)記定義、類型、優(yōu)缺點(diǎn)，掌握分子遺傳標(biāo)記定義、原理和在藥用植物鑒定中的應(yīng)用。熟悉PCR的原理和步驟。2.掌握常用的分子標(biāo)記（RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP）原理和方法。3.重點(diǎn)掌握藥用植物分子鑒定的方法和流程（以柴胡為例）。第一節(jié)遺傳標(biāo)記（geneticmarker）定義：由一對等位基因差異造成的，能夠明確區(qū)分，遺傳傳遞過程可以跟蹤的相對性狀或生物特征。如形態(tài)上的質(zhì)量性狀：花瓣顏色、種子顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。1.形態(tài)標(biāo)記（MorphologicalMarkers）遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征---遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果，這種標(biāo)記可以用于研究物種間關(guān)系、分類和鑒定。如植株高矮、花瓣顏色、葉片顏色、葉片形狀、種子形狀等。優(yōu)點(diǎn)：簡單、直觀缺點(diǎn)：僅對個體性狀的描述，得出的結(jié)論不完善；另外數(shù)量性狀易受環(huán)境影響。遺傳標(biāo)記的類型孟德爾豌豆雜交試驗(yàn)所研究的七對性狀

都是典型的形態(tài)學(xué)遺傳標(biāo)記2.細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（CytologicalMarkers）染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型如數(shù)目、大小、著絲點(diǎn)位置變異等。優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速而經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn)：但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。王喻寧等，20133.生化標(biāo)記（BiochemicalMarkers）生化標(biāo)記：指把植物體內(nèi)的某些生化性狀作為遺傳標(biāo)記，如貯藏蛋白、同工酶等。這種標(biāo)記可用于繪制“指紋圖譜”進(jìn)行植物系統(tǒng)發(fā)育、親緣關(guān)系和種類鑒定研究。同工酶：指夠催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但分子結(jié)構(gòu)、理化特性等不同的一組酶。3.生化標(biāo)記（BiochemicalMarkers）優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低缺點(diǎn)：結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所檢測位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。4.分子標(biāo)記（molecularmarkers）分子標(biāo)記是指能夠被檢測出來的DNA序列上的遺傳多態(tài)性（等位差異）。TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG品種1品種2堿基差異長度差異4.1分子標(biāo)記的檢測方法兩個步驟：獲得目標(biāo)DNA片段：酶切，擴(kuò)增（PCR）檢測不同樣品間目標(biāo)片段的差異（多態(tài)性）：電泳，分子雜交，DNA芯片（高通量）TCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG|||||||||||||||||||||||||||||||||TCTTGTAGACTCACTATAG.....GCGTACATCAGATAG電泳方向品種1品種2品種1品種2長度差異片段電泳檢測：4.2分子標(biāo)記的特點(diǎn)本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達(dá)與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異；（3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個基因組；（4）多數(shù)分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。遺傳學(xué)上，把共顯性定義為F1代中，雙親的性狀同時(shí)表現(xiàn)的現(xiàn)象。共顯性能夠?qū)㈦s合體和純合體從表現(xiàn)上區(qū)分開。共顯性：F1P1F1通過比較藥用植物種間DNA分子遺傳多樣性差異來鑒別其種類的方法。4.3分子標(biāo)記的應(yīng)用：藥用植物分子鑒定狹葉柴胡Bupleurumscorzonerifolium北柴胡BupleurumchinenseChaoetal.2014Phytomedicine

中國柴胡有42種，17變種DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接分析生物的基因型，與上述傳統(tǒng)的方法比較，具有下列優(yōu)點(diǎn)：

遺傳穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，每一個體的任一體細(xì)胞均含有相同的遺傳信息。因此，用DNA分子特征作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行物種鑒別更為準(zhǔn)確可靠。

遺傳多樣性：DNA分子是由G、A、C、T四種堿基構(gòu)成，為雙螺旋結(jié)構(gòu)的長鏈狀分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特定的堿基排列順序中，不同物種遺傳上的差異表現(xiàn)在這4種堿基排列順序的變化，這就是生物的遺傳多樣性(geneticdiversity)。比較物種間DNA分子的遺傳多樣性的差異來鑒別物種就是DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別(identificationbyDNAmoleculargeneticmarker)。

化學(xué)穩(wěn)定性：DNA分子作為遺傳信息的載體，除具有較高的遺傳穩(wěn)定性外，在諸多的生物大分子中，比蛋白質(zhì)、同功酶等具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性。不象蛋白質(zhì)和同功酶那樣，在生物體死亡后，很快失去生物活性，并迅速降解。在陳舊標(biāo)本中所保存下來的DNA仍能夠用于DNA分子遺傳標(biāo)記的研究。4.4分子標(biāo)記的類型分子標(biāo)記的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段，也稱為三代DNA分子標(biāo)記：第一代分子標(biāo)記（以分子雜交為核心）：RFLP；第二代分子標(biāo)記（以PCR為核心）：RAPD；AFLP；SSR；ISSR分子標(biāo)記第三代分子標(biāo)記（以DNA測序?yàn)楹诵模簡魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)；表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)；ITS聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）PCR定義：是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程的體外酶促合成特異性核酸片段的技術(shù)。PCR原理：以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸引物(15-25堿基)介導(dǎo)，通過DNA聚合酶酶促反應(yīng)，在體外進(jìn)行特異DNA序列擴(kuò)增。PCR三步驟①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右5min，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板－引物結(jié)合物于72℃左右在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

小結(jié)與思考小結(jié)：1.四種類型遺傳標(biāo)記中，分子標(biāo)記具有其他遺傳標(biāo)記無法比擬的有點(diǎn)，遺傳穩(wěn)定性、多態(tài)性、化學(xué)穩(wěn)定性，在藥用植物或生藥鑒定中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記。2.PCR技術(shù)是分子標(biāo)記的基礎(chǔ)，PCR原理和步驟為：變性-退火-延伸。思考：1.分子標(biāo)記進(jìn)行藥用植物鑒定依據(jù)的是什么？

2.與三種傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記相比，分子標(biāo)記優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面？

3.理解PCR的原理和步驟。參考書及相關(guān)文獻(xiàn)資料參考書：1.《中藥生物工程》,主編:高文遠(yuǎn),上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.2《中藥現(xiàn)代生物技術(shù)》,主編:胡之璧,人民衛(wèi)生出版社.3.《中藥生物技術(shù)》,主編:賈景明,化學(xué)工業(yè)出版社.參考文獻(xiàn)：1.徐紅,王崢濤,胡之璧.中藥DNA分子鑒定技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[J].中藥現(xiàn)代化,2003,5(2):24-30.2.

海學(xué)忠.DNA分子標(biāo)記在中藥鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中外健康文摘,2012,9(35):442-446.3.陳士林,郭寶林,張貴君等.中藥鑒定學(xué)新技術(shù)新方法研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2012,37(8):1043-1055.第二節(jié)常用的分子標(biāo)記1.限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）RFLP原理：基因組DNA經(jīng)限制酶切，可產(chǎn)生大量長短不一的片段。通過電泳可以將這些片段分離開。片段長的遷移速度慢，短的遷移速度快。如果一對等位基因（序列）的限制酶切片段長度不同，則稱為RFLP。以標(biāo)有放射性同位素或化學(xué)標(biāo)記物質(zhì)、來自特定基因座的DNA片段為探針，可以檢驗(yàn)該座位是否存在多態(tài)性。RFLP原理示意圖左邊：等位序列酶切電泳的結(jié)果右邊：用探針檢驗(yàn)的結(jié)果。1.1產(chǎn)生RFLP的原因點(diǎn)突變：單個堿基的改變（轉(zhuǎn)換或顛換），造成失去某個酶切位點(diǎn)或產(chǎn)生一個新的酶切位點(diǎn)，使突變型酶切片段變長或變短。插入突變：使突變型酶切片段變長。缺失突變：使突變型酶切片段變短。1.2RFLP的檢測方法酶切

電泳

Southern雜交

放射自顯影結(jié)核分枝桿菌基因組RFLP圖譜RFLP的優(yōu)點(diǎn)標(biāo)記廣泛存在于生物體內(nèi)，不受組織、環(huán)境和發(fā)育階段的影響。RFLP標(biāo)記的等位基因是共顯性的，不受雜交的影響，可區(qū)分純合基因與雜合基因?？僧a(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目很多，可覆蓋整個基因組。RFLP的缺點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)需要酶切，對DNA質(zhì)量要求高；RFLP的多態(tài)性程度偏低；分子雜交時(shí)會用到放射性同位素，對人體和環(huán)境都有害；探針的制備、保存和發(fā)放也很不方便；分析程序復(fù)雜、技術(shù)難度大、費(fèi)時(shí)、成本高。1.3RFLP的應(yīng)用1.遺傳學(xué)圖的構(gòu)建結(jié)合RFLP連鎖圖，任何能用RFLP探針檢測出的基因及其DNA片段都可以通過回交，快速有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)移。2.基因定位利用RFLP技術(shù)能夠準(zhǔn)確地標(biāo)記定位種質(zhì)中的目標(biāo)基因，結(jié)合雜交，回交及組織培養(yǎng)等技術(shù)就可以快速有效的將所需目標(biāo)基因的DNA片段引入栽培品種中，實(shí)現(xiàn)品種改良。3.遺傳多態(tài)性分析運(yùn)用RFLP技術(shù)可以盡可能多地保存那些在已知位點(diǎn)上有異態(tài)的品系，以求最大程度地保持品種的多樣性。4.細(xì)胞質(zhì)遺傳研究RFLP技術(shù)是對DNA序列自然變異的直接檢測，只需選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶或DNA探針作分子標(biāo)記，因而對植物不同種屬或雜種后的細(xì)胞質(zhì)遺傳變異及基因型的鑒定具有較高的靈活性和靈敏性，從而能較好地應(yīng)用于細(xì)胞質(zhì)遺傳的研究。2.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）RAPD原理：建立于PCR基礎(chǔ)之上，使用一系列具有10個左右堿基的單鏈隨機(jī)引物，以較低的退火溫度（36℃），對基因組的DNA全部進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測多態(tài)性。由于整個基因組存在眾多反向重復(fù)序列，因此須對每一隨機(jī)引物單獨(dú)進(jìn)行PCR。單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合，使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。

引物結(jié)合位點(diǎn)DNA序列的改變以及兩擴(kuò)增位點(diǎn)之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴(kuò)增片段數(shù)目和長度的差異，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過EB(溴化乙錠)染色以檢測DNA片段的多態(tài)性。RAPD原理示意圖OPA1:5’-CAGGCCCTTC-3’OPD11:5’-AGCGCCATTG-3’OPD8:5’-GTGTGCCCCA-3’OPD11OPD8OPA11北柴胡(陜西)

2北柴胡(河北)

3竹葉柴胡4大葉柴胡5小葉黑柴胡6狹葉柴胡MMarkerRAPD的應(yīng)用-分類鑒定RAPDanalysisof27saffloweraccessionsfromeightdifferentgeographicalregionswithOperonprimerAA-04.AA-04producedsevenpolymorphicbandsLanes1and26:ladder1Kb;Lanes2to27:melon.Arrowsindicatepolymorphicmarkersusedforanalysis.RAPD的優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡單，實(shí)驗(yàn)周期短，信息量大，檢測速度快；DNA用量少；實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單，不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也不需要預(yù)先克隆標(biāo)記或進(jìn)行序列分析；不依賴于種屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析；用一個引物就可擴(kuò)增出許多片段，幾乎覆蓋整個基因組，而且不需要同位素，安全性好。RAPD缺點(diǎn)：顯性遺傳，不能識別雜合子位點(diǎn)，這使得遺傳分析相對復(fù)雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時(shí)，會因顯性遮蓋作用而使計(jì)算位點(diǎn)間遺傳距離的準(zhǔn)確性下降；RAPD對反應(yīng)條件相當(dāng)敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。在RAPD和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上建立了SCAR(Sequencecharacterizedamplifiedregions，序列特異性擴(kuò)增區(qū)域)，CPAS(Cleavedpolymorphicamplifiedsequence，酶切擴(kuò)增多態(tài)序列)和DAF(DNAamplifiedfingerprints，DNA擴(kuò)增指紋)等標(biāo)記技術(shù)。這些技術(shù)的出現(xiàn)，進(jìn)一步豐富和完善了第一代分子標(biāo)記，增加了DNA多態(tài)性的研究手段。3.SSR標(biāo)記技術(shù)SSR原理：在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復(fù)序列，如重復(fù)單位長度在15～65個核苷酸的小衛(wèi)星DNA，重復(fù)單位長度在2～6個核苷酸的微衛(wèi)星DNA。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位點(diǎn)。由于重復(fù)單位的大小和序列不同以及拷貝數(shù)不同,從而構(gòu)成豐富的長度多態(tài)性。

定義：SSR（全稱為簡單序列長度多態(tài)性標(biāo)記）也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其中最常見的是雙核苷酸重復(fù)，即(CA)n和(TG)n，每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10～60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復(fù)數(shù)目不同，因而擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物，這是檢測DNA多態(tài)性的一種有效方法。微衛(wèi)星序列在群體中通常具有很高的多態(tài)性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標(biāo)記。SSR原理示意圖SSR：以2－6個堿基為單位的短重復(fù)序列CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTCTTCTTCCGTACATCAGATAG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAAGATCTTGGATTCTTCTTCTTC......CGTACATCAGATAG上游引物下游引物SSR長度（重復(fù)數(shù)）容易產(chǎn)生變異相對保守相對保守SSR的檢測SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在基因組中數(shù)量豐富，分布較均勻存在復(fù)等位基因，多態(tài)性水平較高一般表現(xiàn)為共顯性，信息完整基于PCR技術(shù)，簡單方便SSR標(biāo)記的缺點(diǎn)開發(fā)成本高，需知道基因組序列，只有全基因組已完成測序的植物才能方便地開發(fā)。4.ISSR（SSR間區(qū)）在SSR序列上設(shè)計(jì)引物PCR檢測相鄰SSR位點(diǎn)之間區(qū)段的長度多態(tài)性穩(wěn)定性比RAPD好SSRSSR上游引物下游引物SNP原理：SNP主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。也即SNP是同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化。

主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換或顛換、以及單堿基的插入或缺失等。5.單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)單核苷酸多態(tài)性（SNP）

數(shù)量非常豐富，有廣闊應(yīng)用前景?！瑿AAGATCTTGGAGACTCACTATAGGCTACGCGTACATCAGATAG…||||||||||||||||||||||||||||||||||||…CAAGACCTTGGAGACTAACTATAG.....GCGTACATCGGATAG…SNP檢測SNP基因型的生化原理SNP的特點(diǎn)：

SNP與RFLP及SSR標(biāo)記的不同有2個方面：其一，SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記；其二，SNP標(biāo)記分析完全摒棄了經(jīng)典的凝膠電泳，代之以最新的DNA芯片技術(shù)。對成千上萬個克隆測序，用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)和顯示最終結(jié)果。檢測：

DNA芯片技術(shù)，最新報(bào)道的微芯片電泳(Microchipelectrophoresis)，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP。雜交型芯片將等位基因特異寡核苷酸共價(jià)固定在載體表面，用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增基因組DNA，再與芯片上的寡核苷酸雜交形成信號，并行讀取芯片上不同SNP熒光信號，獲得SNP信息。SNP的優(yōu)點(diǎn)

數(shù)量多，分布廣泛，檢測快速、易于實(shí)現(xiàn)自動化，遺傳穩(wěn)定性高。SNP的缺點(diǎn)成本高，錯誤信號多。SNP標(biāo)記的應(yīng)用

種群生物學(xué)特征、遺傳性疾病檢測、疾病關(guān)聯(lián)分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因組作圖和數(shù)量性狀定位等方面也有越來越多的應(yīng)用。第三節(jié)藥用植物的分子鑒定流程（實(shí)例）

DNA測序法（DNASequencing）目前用于DNA測序的基因主要有：1.有葉綠體基因組的rbcL、matK；2.核基因組的rRNA、ITS等(植物類)；3.線粒體基因組的cty-b(動物類)。rbcL：基因分辨率高，變異較均一分布，進(jìn)化速率差異大，一般用于科級以上分類群研究。matK：位于trnK基因的內(nèi)含子中，長約1500堿基，編碼成熟酶并參與RNA轉(zhuǎn)錄體中Ⅱ型內(nèi)含子的剪切，是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進(jìn)化速率最快的基因之一，變異較均一，一般用于種一級分類群親緣關(guān)系研究。rRNA是編碼核糖體DNA的基因，在植物中以重復(fù)連續(xù)排列方式存在，包含進(jìn)化速率不等的編碼區(qū)、非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)和轉(zhuǎn)錄區(qū)，可選擇較保守的片斷如18S、5S的rRNA進(jìn)行各種親緣關(guān)系研究。

1.串聯(lián)重復(fù)序列，拷貝可達(dá)500~40000；不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致。核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS

2.序列短，具有長度保守性(ITS1:187-298bp，ITS2:187-252bp)核核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Nuclearribosomeinternaltranscribespacer,ITS

3.核苷酸序列的高度變異性(每個區(qū)成對序列趨異百分率在4~10%)

4.兩側(cè)都有高度保守的序列材料與方法收集中國境內(nèi)柴胡標(biāo)本29種36份，基本涵蓋民間入藥的所有品種。名稱憑證標(biāo)本采集時(shí)間采集地點(diǎn)多枝柴胡B.polyclonum謝暉0405170012004年5月云南會澤川滇柴胡B.candollei謝暉0405170022004年5月云南會澤柴胡（栽培）B.chinense晁志、張道廣03080162003年8月陜西鎮(zhèn)巴小柴胡B.hamiltonii晁志、張道廣03080012003年8月云南昆明狹葉柴胡（紅柴胡）B.scorzonerifolium晁志、張道廣03070012003年7月安徽肥東空心柴胡B.longicaulevar.franchetii晁志、張道廣03080112003年8月陜西鎮(zhèn)巴竹葉柴胡B.marginatum晁志、張道廣03080022003年8月云南昆明抱莖柴胡B.longicaulevar.mplexicaule晁志、張道廣03080032003年8月云南昆明麗江柴胡B.rockii晁志、張道廣03080092003年8月云南麗江柴胡(野生)B.chinense晁志、張道廣03080202003年8月陜西鎮(zhèn)巴汶川柴胡（馬尾柴胡）B.wenchuanense晁志、張道廣03080512003年8月四川汶川馬爾康柴胡B.malconense晁志、張道廣03080532003年8月四川汶川柴首B.chaishoui晁志、張道廣03080542003年8月四川汶川四川柴胡B.sichuanense晁志、張道廣03080522003年8月四川汶川南方大葉柴胡B.longiradiatumf.australe晁志、張道廣03070032003年7月安徽黃山韭葉柴胡B.kunmingense潘勝利03871981年8月云南昆明窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum潘勝利05061993年7月云南昆明線葉柴胡B.angustissimum潘勝利05161993年8月寧夏同心矮小柴胡B.hamiltoniivar.humile潘勝利03201980年8月云南麗江大葉柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum潘勝利04601986年8月黑龍江尚志煙臺柴胡B.chinensef.vanheurckii潘勝利04991992年8月山東青島瀘西柴胡B.luxiense潘勝利04141983年8月云南建水長白柴胡B.komarovianum潘勝利04701986年8月吉林長白山大苞柴胡B.euphorbioides潘勝利04681986年8月吉林長白山大葉柴胡B.longiradiatumvar.breviradiatum王峻03090012003年9月黑龍江細(xì)莖有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum晁志、張道廣03080102003年8月云南麗江北柴胡B.chinense晁志、張道廣03000012003年8月陜西太白山窄竹葉柴胡B.marginatumvar.stenophyllum晁志、張道廣03080552003年8月甘肅柴胡B.gansuense潘勝利05131993年8月甘肅榆中縣柴胡（栽培）B.chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407210012004年7月甘肅小隴山柴胡B.chinense謝暉、劉峰林、徐志斌0407240012004年7月甘肅天水黑柴胡B.smithii謝暉0407270012004年7月甘肅榆中黃花鴨趾柴胡B.commelynoideumvar.flaviflorum謝暉0407280012004年7月甘肅榆中興安柴