第5章-診斷酶學(xué)

DiagnosticEnzymology診斷酶學(xué)什么是酶?酶就是由細(xì)胞合成的，在機(jī)體內(nèi)行使催化功能的生物催化劑。沒(méi)有酶的反應(yīng)有酶催化的反應(yīng)研究酶的醫(yī)學(xué)重要性許多疾病是缺乏某一種酶或者一種酶不合適表達(dá)引起的。酶是許多藥物作用的目標(biāo)。酶有時(shí)可直接被用來(lái)治療某種疾病。存在一種酶或缺乏一種酶經(jīng)常被用來(lái)診斷某些疾病。病毒性肝炎——谷丙轉(zhuǎn)氨酶心肌梗塞——谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、LDH

急性胰腺炎——淀粉酶、脂肪酶

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床化學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目1、肝功13、血尿酸25、纖維蛋白原2、血脂14、膽堿脂酶26、腦脊液生化3、腎功15、糖化血清蛋白27、胸腹水生化4、心肌酶16、蛋白電泳5、血糖17、銅、鋅6、鉀、鈉、氯18、CRP免疫球蛋白7、鈣、鎂、磷19、脂肪酶8、血淀粉酶20、亮氨酸轉(zhuǎn)移酶9、堿性磷酸酶21、生化全項(xiàng)（肝、腎、脂、心、離子）10、酸性磷酸酶22、24小時(shí)尿肌酐11、GGT轉(zhuǎn)肽酶23、尿淀粉酶12、乳酸脫氫酶24、糖化血紅蛋白包鋼醫(yī)院(內(nèi)醫(yī)第三附院)生化檢驗(yàn)申請(qǐng)單1.生化Ⅰ號(hào):A.Glu;B.Urea,Cr;C.Tco2;D.UA;E.K,Na,Cl;F.Ca,P,Mg;G.AmyLps;H.ALT,AST,TP,Alb,T.Bil,D.Bil;I.AST,LDH,α-HBDH,CK,CK-MB;J.TG,TC,HDL-C,LDL-C;K.ApoA,ApoB2.生化Ⅱ號(hào)A.血清蛋白電泳;B.GGT,ALP;

C.TBA,GLDH,PA,MAO;D.CHE,;E.Fe,Tf;F.LDH

G.DMF(果糖胺)H.CP(銅藍(lán)蛋白)I.AFU3.其它生化項(xiàng)目:A.CCr(內(nèi)生肌酐清除率);B.腦脊液生化;C.血?dú)夥治?D.漿膜腔積液生化;E.氨;F.UmAlb(尿微量蛋白)4.免疫Ⅰ號(hào):A.CRP;B.IgG,IgM,IgA;C.C3,C4代號(hào)中文名稱結(jié)果參考值單位TBil總膽紅素2-20umol/LDBil直接膽紅素0-6umol/L

IBil

間接膽紅素2-19umol/lALT谷丙轉(zhuǎn)氨酶0-42U/LTP總蛋白60-83g/LALB白蛋白35-55g/LGLB球蛋白20-30g/LA/G白球比1.5-2.5GGTY-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶11-61U/LAST谷草轉(zhuǎn)氨酶0-37U/LHBsAg

乙肝表面抗原陰性包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)報(bào)告單肝功代號(hào)中文名稱結(jié)果參考值單位AST谷草轉(zhuǎn)氨酶0-37U/LLDH乳酸脫氫酶80-285U/L

CK肌酸肌酶0-190U/LCK_MB肌酸肌酶同工酶0-24U/LHBDHa-羥丁酸脫氫酶72-182U/L包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)報(bào)告單心肌酶譜

主要內(nèi)容

六、同工酶和亞型的測(cè)定

一、酶的一般特征

二、血清酶

三、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

四、酶活性濃度測(cè)定技術(shù)五、酶的免疫化學(xué)測(cè)定

七、工具酶及其臨床應(yīng)用

八、臨床常用血清酶及其同工酶一、酶的組成、結(jié)構(gòu)和功能

第一節(jié)酶的概念與特征

三、酶的命名分類及編號(hào)

二、酶的催化作用機(jī)制

1.本質(zhì)：絕大部分是蛋白質(zhì)，少部分酶蛋白復(fù)合物與核酶.一、酶的組成、結(jié)構(gòu)與功能

AllenzymesareproteinsexceptsomeRNAsandnotallproteinsareenzymes1、單純酶(simpleenzyme)：?jiǎn)渭兊鞍踪|(zhì)

酶蛋白（apoenzyme）

輔助因子：（金屬離子小分子有機(jī)物）

2、結(jié)合酶:或全酶

2、酶的結(jié)構(gòu)輔基(prostheticgroup):

共價(jià)鍵；結(jié)合緊密輔酶(coenzyme):非共價(jià)鍵；結(jié)合疏松可用透析或超濾除去金屬離子是最多見(jiàn)的輔助因子小分子有機(jī)化合物在催化中的作用輔酶或輔基多為小分子有機(jī)化合物二、酶的催化作用機(jī)制(一）酶的活性中心:能結(jié)合并催化一定底物使之發(fā)生化學(xué)變化的位于酶分子上特定空間結(jié)構(gòu)區(qū)域。必須基團(tuán)：一些與酶活性密切相關(guān)的化學(xué)基團(tuán)。

結(jié)合基團(tuán)（bindinggroup)催化基團(tuán)(catalyticgroup)S-S活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心必需基團(tuán)底物

肽鏈活性中心酶活性中心示意圖底物活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)活性中心SEE-S復(fù)合物abcabc（二）誘導(dǎo)契合假說(shuō)（induced-fithypothesis）ES反應(yīng)總能量改變非催化反應(yīng)活化能酶促反應(yīng)活化能一般催化劑催化反應(yīng)的活化能能量反應(yīng)過(guò)程底物產(chǎn)物

酶促反應(yīng)活化能的改變

活化能：底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量。酶促反應(yīng)總結(jié)：1、為何具有高度催化效率——降低反應(yīng)活化能2、如何降低活化能——形成中間產(chǎn)物3、如何形成中間產(chǎn)物——誘導(dǎo)契合作用三、

酶的命名與分類(一)習(xí)慣命名法(二)國(guó)際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名應(yīng)包括；底物（構(gòu)型）、酶作用的基團(tuán)、催化反應(yīng)的類型習(xí)慣名稱系統(tǒng)名稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶丙氨酸

：α－酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶乙醇脫氫酶

乙醇：NAD+氧化還原酶（三）國(guó)際系統(tǒng)分類法及酶的編號(hào)（蛋白類酶）1、氧化還原酶（1）AH2＋B＝A＋BH22、轉(zhuǎn)移酶

（2）AB＋C＝A＋BC3、水解酶

（3）AB＋H2O＝AOH＋BH4、裂合酶（4）AB＝A＋B5、異構(gòu)酶

（5）A＝B6、連接酶或合成酶（6）A＋B＋ATP＝AB＋ADP＋Pi

或A＋B＋ATP＝AB＋AMP＋PPi六大類編號(hào)依次為1.2.3.4.5.6亞類編號(hào)依次為

1.2.3.4.5.6…….亞－亞類編號(hào)依次為1.2.3.4.5.6…….臨床常用酶的名稱與編號(hào)EC編號(hào)習(xí)慣用名英語(yǔ)縮寫EC編號(hào)習(xí)慣用名英語(yǔ)縮寫1.1.1.27乳酸脫氫酶LD、LDH2.7.3.2肌酸激酶CK、CPK1.1.1.37蘋果酸脫氫酶MD、MDH3.1.1.3脂肪酶LPS1.1.1.41異檸檬酸脫氫酶ICD、ICDH3.1.1.8膽堿酯酶CHE1.1.1.496-磷酸葡萄糖脫氫酶G6PDH3.1.3.1堿性磷酸酶ALP、AKP1.4.1.3谷氨酸脫氫酶GLD、GLDH3.1.3.2酸性磷酸酶ACP1.4.3.4單氨氧化酶MOD3.1.3.55'-核苷酸酶5'-NT2.1.3.3鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶OCT3.2.1.1α-淀粉酶AMY、AMS2.3.2.2γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶γ-GT、GGT3.2.1.30β-N-乙酰(基)-D氨基葡萄糖苷酶NAG2.4.1.1糖原磷酸化酶GP3.2.1.51α-L-巖藻糖苷酶α-FU、AFU2.5.1.18谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST3.4.23.1亮氨酸氨基肽酶LAP2.6.1.1門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、GOT4.1.2.13果糖二磷酸醛縮酶ALD2.6.1.2丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、GPT一、血清酶的來(lái)源與去路

第二節(jié)血清酶二、血清酶的生理差異

三、血清酶變化的病理機(jī)制

名稱

血漿特異酶

非血漿特異酶

外分泌酶細(xì)胞酶一般代謝酶組織專一酶來(lái)源肝消化腺或其它外分泌腺

各組織器官（無(wú)器官專一性）肝（有器官專一性）

種類凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纖溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK等

OCT等

一、血清酶的來(lái)源

酶合成異常:合成減少/合成增多酶釋放增加:

與下列因素有關(guān)細(xì)胞內(nèi)外酶濃度差異酶蛋白分子量的大小酶的組織分布酶在細(xì)胞內(nèi)定位和存在形式酶的清除異常不同疾病和不同的酶從血中清除時(shí)間和機(jī)制不同。如AMY和ALP經(jīng)腎臟或膽道排出異常而致血清酶升高。二、血清酶變化的病理機(jī)制（一）合成異常合成減少合成增多肝損害導(dǎo)致合成酶的能力受損（ChE、LCAT）酶基因變異引起酶合成減少（銅氧化酶）增生性疾?。ü趋兰膊?，ALP)惡性腫瘤（前列腺癌，ACP)酶的誘導(dǎo)作用（乙醇，γ-GT）二、血清酶變化的病理機(jī)制三、血清酶的生理差異

性別年齡進(jìn)食運(yùn)動(dòng)妊娠其他堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的年齡差異（K-A法，IU）表02-3健康人激烈運(yùn)動(dòng)停止后休息時(shí)的血漿酶活性的變化情況一、酶促反應(yīng)

第三節(jié)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction三、酶促反應(yīng)進(jìn)程

四、影響酶促反應(yīng)的因素

二、Km與Vmax

Michaelis和Menten提出的酶作用的中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō):

一、酶促反應(yīng)

K1K2K3酶-底物復(fù)合物的形成&過(guò)渡態(tài)（transitionstate）1913年Michaelis和Menten提出米曼氏方程（Michaelisequation)

----解釋[S]和V之間的關(guān)系米氏方程（Michaelisequation)

----解釋[S]和V之間的關(guān)系Vmax[S]Km+[S]V=V：不同[S]時(shí)的反應(yīng)速度[S]：底物濃度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

二、Km與Vmax

Km值：等于酶促反應(yīng)的初速率為最大速率Vmax一半時(shí)的底物濃度，即V＝?Vmax時(shí)，則Km＝[S]。Vmax：酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，代表了在一定酶量下的最大反應(yīng)速率。Km是酶的特征性常數(shù)Km在臨床上的應(yīng)用：

反映酶與底物的親合力，且與親合力成反比。用來(lái)計(jì)算不同底物濃度時(shí)酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度的百分率。根據(jù)Km值選擇酶的最適底物。確定工具酶用量。確定代謝酶系中的限速反應(yīng)和作為鑒別酶的依據(jù)。

[S]

1v1~V＝Km+[S]Vmax[S]v1雙倒數(shù)作圖法

酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線(S為底物，P為產(chǎn)物)三、酶促反應(yīng)進(jìn)程

線性期延滯期非線性期如將酶反應(yīng)過(guò)程中測(cè)得的產(chǎn)物[P]或底物[S]變化量對(duì)時(shí)間作圖，可得酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線。圖中產(chǎn)物[P]或底物[S]變化曲線的斜率就代表酶促反應(yīng)的速率。延滯期線性反應(yīng)期底物耗盡期——必須根據(jù)線性反應(yīng)期的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度。四、影響酶促反應(yīng)的因素

酶濃度底物的種類和濃度緩沖液的種類、離子強(qiáng)度和pH溫度激活劑與抑制劑

酶濃度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

在底物濃度足夠大，則反應(yīng)速度與[E]成正比。

一、底物濃度[S]對(duì)反應(yīng)速度(V)的影響條件：當(dāng)[E]不變時(shí)，[S]對(duì)反應(yīng)速度的影響為

矩形雙曲線

VmaxV[S]當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比[S]VVmax隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速[S]VVmax當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度[S]VVmax常見(jiàn)酶溫度轉(zhuǎn)化系數(shù)25℃30℃37℃CK0.641.001.56LD0.751.001.44ALT0.761.001.38AST0.731.001.52ALP0.781.001.30GGT0.731.001.31CHE0.811.001.26HBDH0.851.001.10臨床溫度范圍：37℃±0.1℃溫度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響影響的雙重性最適溫度：酶的保藏：低溫下，以固體保存為好。溫血?jiǎng)游镆话阍?5℃-40℃植物酶稍高在40℃-50℃

T（℃）V最適溫度pH對(duì)酶反應(yīng)的影響酶反應(yīng)的最適pHpH影響酶活力的原因

過(guò)酸、過(guò)堿都會(huì)使酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變。pH的改變能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離。pH也會(huì)影響底物分子的解離狀態(tài)。最適pHVpH動(dòng)物酶多在

pH6.5~8.0植物及微生物酶

pH4.5~6.5

第四節(jié)酶活性濃度測(cè)定技術(shù)

一、酶活性濃度測(cè)定方法

二、酶偶聯(lián)法

三、血清酶活性濃度測(cè)定條件的選擇

四、酶活性濃度的單位

五、臨床酶學(xué)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化

1.定時(shí)法連續(xù)監(jiān)測(cè)法：量氣法分光光度法熒光法其它方法（放射性核素法、離子選擇電極法，旋光法、極譜法、HPLC或生物發(fā)光法等）。按反應(yīng)時(shí)間按檢測(cè)方法

一、酶活性濃度測(cè)定方法

定時(shí)法（fixedtimeassay）

（終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）

測(cè)定酶與底物作用反應(yīng)一定時(shí)間后底物或產(chǎn)物變化的總量，計(jì)算酶促反應(yīng)平均速度。優(yōu)點(diǎn)：比較簡(jiǎn)單，所用儀器無(wú)需恒溫裝置，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)：無(wú)法知道是否處于線性期。

連續(xù)監(jiān)測(cè)法的時(shí)間進(jìn)程曲線

連續(xù)監(jiān)測(cè)法continuousmonitoringassay）

在酶促反應(yīng)過(guò)程中連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間的變化量，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)須終止酶促反應(yīng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

要求檢測(cè)儀器具有恒溫裝置及自動(dòng)檢測(cè)功能，半/全自動(dòng)生化分析儀都能達(dá)到這些要求。（一）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的種類

直接法

是指待測(cè)酶酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物有特征性的理化性質(zhì)，然后通過(guò)特殊的儀器直接檢測(cè)。

間接法

是指酶促反應(yīng)底物和產(chǎn)物之間沒(méi)有特征性的理化性質(zhì)，需通過(guò)另一個(gè)化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)，將底物或產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為有明顯特征理化性質(zhì)的另一個(gè)化合物。

酶偶聯(lián)法

L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD在反應(yīng)過(guò)程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同時(shí)使NAD+還原為NADH，NADH在340nm處有吸收峰，因此反應(yīng)會(huì)引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率與樣本中活性呈正比關(guān)系。

連續(xù)監(jiān)測(cè)法

測(cè)定乳酸脫氫酶的活性

Ex為待測(cè)酶，A為底物，B為中間產(chǎn)物。A、B二物質(zhì)的變化無(wú)法直接監(jiān)測(cè)，此時(shí)可外加第二個(gè)酶Ei(為指示酶)，其底物為B，反應(yīng)產(chǎn)物為P可直接測(cè)定。（二）酶偶聯(lián)法

酶偶聯(lián)反應(yīng)

最簡(jiǎn)單的模式為：

輔助反應(yīng)

如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時(shí)還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加入另一種酶，將二者連在一起，此反應(yīng)稱為輔助反應(yīng)。模式為：

其中，B、C均為中間產(chǎn)物，Ea、Ei都為工具酶。最后一個(gè)酶稱指示酶Ei，其他外加的酶都為輔助酶（Ea）。連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定ALT

原理L-丙氨酸+a-酮二酸L-谷氨酸+L-丙氨酸丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD+（340nm)谷丙轉(zhuǎn)氨酶乳酸脫氫酶酶偶聯(lián)法測(cè)定ALT的吸光度變化圖

方法條件的選擇

盡可能采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法；減少步驟,化學(xué)試劑有一定純度,雙蒸水,使用雙試劑。

測(cè)定參數(shù)的設(shè)置

方法類型、波長(zhǎng)、樣品量與試劑量、稀釋水量、試劑吸光度上下限、空白速率、反應(yīng)孵育時(shí)間、延遲,監(jiān)測(cè)時(shí)間、底物耗盡限額、線性范圍及計(jì)算因子F值。

標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存

影響因素：溶血、抗凝劑、溫度等。

干擾因素的控制

反應(yīng)干擾；污染；底物自行發(fā)生反應(yīng)。三、血清酶活性濃度測(cè)定條件的選擇

標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存溶血：細(xì)胞內(nèi)酶而言，細(xì)胞內(nèi)外濃度差異大；所以應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分離，靜脈采血后應(yīng)在1～2h內(nèi)分離血清?？鼓齽豪貌菟猁}、枸櫞酸鹽、EDTA抗凝的血漿一般不用作酶活性測(cè)定；肝素對(duì)ALT、AST、CK、LD、ACP檢測(cè)均無(wú)影響，可用于急診；臨床多用血清為首選測(cè)定標(biāo)本。溫度：大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，一般在血清分離當(dāng)天測(cè)定，否則應(yīng)放冰箱冷藏；通常在0～4°C下使用、處理及保存，除了一些冷變性的酶；液氮可作為酶學(xué)測(cè)定時(shí)血清標(biāo)本及質(zhì)控長(zhǎng)期保存的方法。不同貯存溫度時(shí)體液酶的穩(wěn)定性

酶室溫（25℃）冷藏（0～4℃）冰凍（-25℃）LD1周1～3d§1～3d§

-GT2d1周1月ALD2d2d不穩(wěn)定*ALT2d5d不穩(wěn)定*AST3d1周1月CK1周1周1月ChE1周1周1周ALP2～3d2～3d1月ACP4h※3d#3d#5’-NT24h1周3月AMY1月7月2月LPS1周3周3周LAP1周1周1周*酶不耐融化；§與同工酶類型有關(guān)；※標(biāo)本未酸化；#標(biāo)本加枸櫞酸或醋酸至pH5慣用單位慣用單位是酶活性測(cè)定方法的建立者所規(guī)定的單位。由于單位定義不同，參考范圍差別很大，難以進(jìn)行比較。國(guó)際單位（IU）在特定的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1

mol底物的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。以IU表示，1IU=1

mol.min-1。Katal單位在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量為1kat，1kat=1mol.s-1。常用單位為

katal或nkatal。Kat與IU的換算關(guān)系為：1IU=1

mol·min-1=16.67nmol·s-1=16.67nkatal四、酶活性濃度的單位

酶活性濃度單位

臨床上酶活性濃度采用每單位體積（升）所含的酶活性單位數(shù)表示。U/L酶活性濃度單位的計(jì)算連續(xù)監(jiān)測(cè)法根據(jù)摩爾消光系數(shù)進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。公式如下：正常上限倍數(shù)正常上限升高倍數(shù)（upperlimitsofnormal,ULN）是指把酶測(cè)定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是用測(cè)得的酶活性結(jié)果除以參考范圍的上限值。酶的質(zhì)量分析利用酶蛋白分子具有抗原性的特點(diǎn)，可以通過(guò)抗原抗體反應(yīng)的原理直接測(cè)定酶的質(zhì)量，報(bào)告方式用質(zhì)量濃度單位。如用免疫學(xué)方法測(cè)定CK-MB質(zhì)量，結(jié)果用ng/ml或ug/L報(bào)告。

第五節(jié)同工酶及亞型的測(cè)定

一、同工酶的概念及分類

二、同工酶的分析方法人體中幾種重要的同工酶

酶同工酶種類相關(guān)疾病CKCK-BB,CK-MB,CK-MM(CK1,CK2,CK3)心梗,肌病,顱腦損傷,腫瘤LDLD1,LD2,LD#,LD4,LD5心梗,肌病,梗死,肝病,腫瘤ALP肝,小腸,骨,胎,腎肝膽疾病,骨病,妊娠,結(jié)腸炎,腫瘤ACP細(xì)細(xì)胞,前列腺,溶酶體前列腺癌,血液病,骨腫瘤ALTALTs,ALTm心梗,肝病ASTASTs,ASTm心梗,肝病AMYP-AMY(P1,P2,P3),S-AMY(S1,S2,S3,S4)急慢性胰腺炎,腮腺炎Y-GTY-GT1,Y-GT2,Y-GT3,Y-GT4肝癌,梗阻性疾病1、概念：是催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器分布不同的一組酶。

2、亞型:指基因在編碼過(guò)程中由于翻譯后修飾的差異形成的多種形式的一類酶。往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋入血漿時(shí)因肽酶作用降解而形成。一、同工酶的概念及分類

HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)乳酸脫氫酶的同工酶*舉例：乳酸脫氫酶(LDH1～

LDH5)心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345*生理及臨床意義在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用；用于解釋發(fā)育過(guò)程中階段特有的代謝特征；同工酶譜的改變有助于對(duì)疾病的診斷；同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。二、同工酶的分析方法

方法同工酶(或亞型)的性質(zhì)差異同工酶、亞型電泳法電荷不同所有同工酶、亞型層析法(離子交換層析、親和層析)電荷不同CK，LD，ALP免疫分析法免疫抑制法特異性抗體反應(yīng)性不同CK、LD、ACP免疫化學(xué)測(cè)定法特異性抗體反應(yīng)性不同CK、LD、ACP、ALP、AMY動(dòng)力學(xué)分析法底物特異性分析法底物Km、親和力不同ACP、CK、LD（

-羥丁酸）抑制劑分析法對(duì)小分子量的抑制劑的特異性抑制不同LD（草酸）、ACP（L-酒石酸）、ALP（L-苯丙氨酸）pH分析法最適pH不同AST熱失活分析法熱穩(wěn)定性不同ALP蛋白酶水解法對(duì)蛋白水解酶敏感度不同LD、AST電泳法

電泳材料：醋酸纖維素薄膜、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、等電聚焦及毛細(xì)管電泳等。區(qū)帶顯色：各同工酶區(qū)帶進(jìn)行酶促反應(yīng)顯色后，掃描定量，而顏色的深淺與同工酶活性成正比。

第六節(jié)工具酶及其臨床應(yīng)用

一、工具酶

二、代謝物的酶法測(cè)定

（一）概念：在酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱為工具酶。一、工具酶

縮寫符號(hào)名稱縮寫符號(hào)名稱HDL乳酸脫氫酶HK已糖激酶MDH蘋果酸脫氫酶CK肌酸激酶G-6-PD6-磷酸葡萄糖脫氫酶PK丙酮酸激酶GLDH谷氨酸脫氫酶GK甘油激酶GOD葡萄糖氧化酶LPL脂蛋白脂肪酶COD膽固醇氧化酶CE膽固醇酯酶GPD磷酸甘油氧化酶脲酶POD過(guò)氧化物酶肌酐酶常用工具酶的名稱及其縮寫符號(hào)（二）工具酶參與的指示反應(yīng)（共通反應(yīng)途徑）偶聯(lián)H2O2工具酶及指示反應(yīng)：如常用的Trinder反應(yīng)。NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng)：利用氧化-還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反應(yīng)后，直接測(cè)定NAD(P)H的變化量。共通反應(yīng)途徑:1．脫氫酶

用作工具酶的脫氫酶都是以NAD(P)H為輔酶的脫氫酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它們催化下列反應(yīng)：

P+NAD(P)H+H+

PH2+NAD(P)+NAD(P)H在340nm最大吸收峰。應(yīng)用：ALT、AST、CK等酶活性測(cè)定。連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定ALT

原理L-丙氨酸+a-酮二酸L-谷氨酸+L-丙氨酸丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD+（340nm)谷丙轉(zhuǎn)氨酶乳酸脫氫酶2．過(guò)氧化物酶

POD可催化過(guò)氧化氫與某些色原反應(yīng)，例如與4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反應(yīng)，將其氧化為有色物質(zhì)，反應(yīng)如下：

Trinder反應(yīng)：

POD2H2O2+4-AAP+酚醌亞胺（紅色）+4H2O應(yīng)用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（屬于氧化酶類）等都可以將各自的底物氧化為過(guò)氧化氫，因此都可以與POD偶聯(lián)，通過(guò)Trinder反應(yīng)加以測(cè)定。500nm

LPL甘油三酯+3H2O甘油+脂肪酸

甘油激酶甘油+ATP甘油-3-磷酸+ADP

磷酸甘油氧化酶

甘油-3-磷酸+O2磷酸二羥丙酮+H2O2

GPO

(trinder反應(yīng))H2O2+4-氨基安替比林+4-氯酚醌亞胺+2H2O+Hcl

POD（紅色，500nm吸收峰）生成醌亞胺顯色程度與TG濃度成正比。過(guò)氧化物酶磷酸甘油氧化酶法測(cè)定血清甘油三酯GODPL葡萄糖+H2O+O2葡萄糖酸+H2O2

(trinder反應(yīng))H2O2+4-氨基安替比林+4-氯酚醌亞胺+2H2O

（紅色，505nm吸收峰）生成醌亞胺顯色程度與血清中葡萄糖濃度成正比。葡萄糖氧化酶過(guò)氧化物酶葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清葡萄糖

第八節(jié)臨床常用血清酶及其同工酶

二、

-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶

三、肌酸激酶及其同工酶

四、乳酸脫氫酶及其同工酶

五、堿性磷酸酶及其同工酶

六、酸性磷酸酶及其同工酶

七、淀粉酶及其同工酶

八、脂肪酶

九、膽堿酯酶

一、轉(zhuǎn)氨酶及其同工酶

一、轉(zhuǎn)氨酶及其同工酶

生化特性丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙）：ALT(GPT)（天）門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草）：AST(GOT)

組織分布AST:主要分布于心、肝、骨胳肌、腎。同工酶：ASTs；ASTm正常血清主要為ASTs，當(dāng)細(xì)胞受到輕度損傷時(shí)ASTs顯著升高。若血清中出現(xiàn)大量的ASTm，則表示細(xì)胞嚴(yán)重受損。ALT：主要分布于肝、腎、心、骨胳肌。有兩種同工酶：ALTs、ALTm，反映肝損傷靈敏指標(biāo).轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定方法

目前，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室多采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。ALT速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：AST速率法測(cè)定中酶偶聯(lián)反應(yīng)式為：

轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定的臨床意義急性肝損害:ALT的升高常與病情輕重相平行，為判斷急性肝炎恢復(fù)的指標(biāo)。是肝壞死的前兆。心臟、骨骼肌等組織受損、肝膽疾病時(shí)血清ALT水平也可出現(xiàn)不同程度的升高。心肌、肝臟損傷血清AST會(huì)升高。腎臟或胰腺細(xì)胞損傷，血清AST也會(huì)升高。在AMI患者胸前區(qū)疼痛發(fā)作后6～8h，血清AST可明顯升高，發(fā)病后48～60h達(dá)峰值，4～5天可降至正常。轉(zhuǎn)氨酶輕度增加(1～3ULN)：胰腺炎、酒精性脂肪肝、肝硬化、肉芽腫、腫瘤等。中度增加(3～10ULN)的疾?。簜魅拘粤馨驮龆喟Y、慢性活動(dòng)性肝炎、肝外膽道梗塞、心肌梗死等。重度增加(>20ULN)的疾?。翰《拘愿窝?、中毒性肝炎。代號(hào)中文名稱結(jié)果參考值單位TBil

總膽紅素18.52-20umol/LDBil直接膽紅素40-6umol/L

IBil

間接膽紅素12.72-19umol/lALT

谷丙轉(zhuǎn)氨酶43.60-42U/LTP

總蛋白6560-83g/LALB

白蛋白3835-55g/LGLB球蛋白2220-30g/LA/G

白球比2.21.5-2.5GGTY-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶4511-61U/LAST谷草轉(zhuǎn)氨酶240-37U/LHBsAg乙肝表面抗原陰性包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)報(bào)告單代號(hào)中文名稱結(jié)果參考值單位TBil

總膽紅素18.52-20umol/LDBil直接膽紅素40-6umol/L

IBil

間接膽紅素12.72-19umol/lALT

谷丙轉(zhuǎn)氨酶43.60-42U/LTP

總蛋白6560-83g/LALB

白蛋白3835-55g/LGLB球蛋白2220-30g/LA/G

白球比2.21.5-2.5GGTY-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶12311-61U/LAST谷草轉(zhuǎn)氨酶450-37U/LHBsAg乙肝表面抗原陰性包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)報(bào)告單酒精性肝炎代號(hào)中文名稱結(jié)果參考值單位TBil

總膽紅素262-20umol/LDBil直接膽紅素140-6umol/L

IBil

間接膽紅素24.72-19umol/lALT

谷丙轉(zhuǎn)氨酶43.60-42U/LTP

總蛋白4660-83g/LALB

白蛋白2335-55g/LGLB球蛋白4220-30g/LA/G

白球比0.551.5-2.5GGTY-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶7211-61U/LAST谷草轉(zhuǎn)氨酶390-37U/LHBsAg乙肝表面抗原陰性包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)報(bào)告單肝硬化二、-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶

生化特性

-GT或GGT是一種含巰基的線粒體酶。組織分布

分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織中，其中以腎臟含量最多。

血清中GGT主要來(lái)源于肝膽系統(tǒng)。IFCC參考方法

采用L-

-谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺(GCNA)作為底物，以甘氨酰甘氨酸（雙甘肽）作為-谷氨?；氖荏w。在pH7.7的條件下，-GT催化底物生成-谷氨酰雙甘肽和黃色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，在410nm波長(zhǎng)處直接連續(xù)監(jiān)測(cè)，吸光度的增高速率與-GT活性成正比關(guān)系。GGT測(cè)定的臨床意義(1)膽道疾病膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻等升高明顯。(2)肝實(shí)質(zhì)疾病肝炎、脂肪肝、肝硬化時(shí)中度升高。慢性肝炎活動(dòng)期GGT多增高，非活動(dòng)期則多正常。原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌時(shí)不同程度的增高。(3)誘導(dǎo)作用對(duì)乙醇性中毒的判斷有一定的價(jià)值。長(zhǎng)期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者升高。

三、肌酸激酶及其同工酶

生化特性由兩種不同亞基（M和B亞基）組成的二聚體。同工酶分：CK-BB（CK1）、CK-MB（CK2）、CK-MM（CK3）和CK–Mt(CK4)。組織分布

廣泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦組織。CK-BB在腦和脊髓內(nèi)含量最高稱為腦型同工酶。

CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞內(nèi)稱為心型同工酶。分為CK-MB1\CK-MB2亞型。骨骼肌中幾乎全部為CK-MM，稱為肌型同工酶。分為CK-MM1\CK-MM2\CK-MM3亞型。CK的測(cè)定方法

IFCC測(cè)定CK的參考方法為酶偶聯(lián)法。CK同工酶和亞型的測(cè)定方法

現(xiàn)推薦用免疫化學(xué)方法直接測(cè)定CK-MBmass，可不受溶血和巨CK的干擾。CK同工酶亞型（CK-MM亞型和CK-MB亞型）多用瓊脂糖凝膠高壓電泳和等電聚焦電泳等。CK及其同工酶測(cè)定的臨床意義主要用于早期診斷AMI（1）血清CK總活力AMI后2～4h開始升高，10～24h達(dá)峰值，3～4天恢復(fù)正常。（2）CK同工酶及亞型AMI胸痛發(fā)作后，血清CK-MB的上升先于其CK總活性，CK-MB/CK＞0.03可診斷為AMI。CK-MM亞型的測(cè)定：以CK-MM3/CK-MM1＞1.0作為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)。CK-MB2亞型：在AMI早期診斷和判斷有無(wú)再灌注上同樣有很高的靈敏度和特異性。一般以CK-MB2＞1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1＞1.5作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。肌肉疾病:

AMI時(shí)心肌酶時(shí)相變化

四、乳酸脫氫酶及其同工酶

生化特性

乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中的一種重要酶。LD除催化L-乳酸外還可催化α-羥丁酸、γ-酮丁酸進(jìn)行脫氫反應(yīng)。

α-羥基丁酸脫氫酶（α-HBD)組織分布

LD位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種糖酵解酶。LD是由H（心型）和M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體。5種同工酶(LD1,LD2,LD3,LD4,LD5)。

LD的測(cè)定方法目前多用連續(xù)監(jiān)測(cè)法。LD-P法：以丙酮酸為底物（反應(yīng)方向P

L）的逆向反應(yīng)（稱LD-P法）。LD-L法：以乳酸為底物（反應(yīng)方向L

P）的順向反應(yīng)（稱LD-L法）。為IFCC參考方法（pH為9.4）。通過(guò)在340nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)NAD+還原成NADH吸光度的增加速率而計(jì)算LD活性。LD同工酶的測(cè)定方法

常用電泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以瓊脂糖凝膠電泳法更多用。一般成年人存在如下規(guī)律：LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5，部分正常兒童血中可見(jiàn)LD1＞LD2。LD及其同工酶測(cè)定的臨床意義心肌梗死LD心肌酶中升高最晚，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。急性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎和肝癌時(shí)，LD明顯升高。LD同工酶主要用于AMI和肝病的診斷AMI:LD1升高最為顯著，LD1/LD2＞1，視為診斷AMI的一個(gè)特異指標(biāo)。肝膽疾病:LD5升高常表示有肝細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞性黃疸時(shí)LD5＞LD4，阻塞性黃疽時(shí)LD4＞LD5。腫瘤:肝癌時(shí)可伴有LD4和LD5明顯增高；白血病、膠原病時(shí)以LD3、LD4增高為主。惡性貧血:心肌酶譜谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)乳酸脫氫酶(LD)肌酸肌酶CK)肌酸肌酶同工酶(CK-MB)α-羥基丁酸脫氫酶（α-HBD)心肌損傷標(biāo)志物肌酸肌酶CK)肌酸肌酶同工酶(CK-MB)心肌肌鈣蛋白肌紅蛋白五、堿性磷酸酶及其同工酶

生化特性

在堿性條件下（最適pH為10左右）能水解很多磷酸單酯化合物的酶。組織分布ALP廣泛分布，含量依次為肝、腎、胎盤、小腸、骨骼等。血清中的ALP主要來(lái)自肝臟和骨骼，是膽汁淤滯的酶學(xué)指標(biāo)。同工酶：胎盤ALP、腸ALP和肝/骨/腎ALP同工酶。ALP的測(cè)定方法(1)磷酸苯二鈉比色法：測(cè)定ALP水解底物產(chǎn)生的酚。(2)連續(xù)監(jiān)測(cè)法：我國(guó)及IFCC的推薦方法。

ALP測(cè)定的臨床意義肝膽疾病各種肝內(nèi)、外膽管阻塞引起的膽汁淤積性疾病，ALP明顯升高，且ALP升高與膽紅素平行.甲亢、惡性骨損傷、佝僂病、骨折、指端肥大癥所致骨損傷等.妊娠后期及兒童生長(zhǎng)期ALP增高.血清ALP活性降低：主要見(jiàn)于呆小病、維生素C缺乏癥、甲狀腺功能低下、惡性貧血等。六、酸性磷酸酶及其同工酶

生化特性

在酸性條件下水解各種正磷酸單酯的酶。組織分布ACP主要存在于細(xì)胞溶酶體。血清中ACP主要來(lái)源于前列腺，正常男性血清中的ACP約有1/3～1/2來(lái)自前列腺，其余則與女性血中的ACP一樣可能來(lái)自血小板或破骨細(xì)胞。

ACP測(cè)定的臨床意義前列腺疾?。菏窃\斷前列腺癌最重要的指標(biāo)之一。骨?。簮盒怨悄[瘤、變形性骨炎、多發(fā)性骨髓瘤等輕度增高。肝?。焊伟?、肝硬化血液病：七、淀粉酶及其同工酶

生化特性

AMY作用的最適pH在6.5～7.5。分子量40000～50000，易從腎臟排出。半壽期很短，約為2h。兩種同工酶：唾液型(S-AMY)

胰型(P-AMY)。組織分布主要存在于胰腺、唾液腺、

AMY測(cè)定的臨床意義AMY活性增高急性胰腺炎發(fā)病后3～6h開始升高，12～24h達(dá)峰值，2～5天下降恢復(fù)至正常。超過(guò)500U有意義。慢性胰腺炎急性發(fā)作、胰腺癌等AMY升高。急腹癥如急性闌尾炎、腸梗阻、潰瘍現(xiàn)穿孔等，血清

AMY可升高。這些病變可波及胰腺，較急性胰腺炎為低。AMY活性降低主要見(jiàn)于肝炎、肝硬化等。八、脂肪酶

生化特性

脂肪酶（lipase，LPS）又稱甘油三酯酶，胰腺外分泌酶。組織分布

血清中LPS主要來(lái)源于胰腺的腺泡細(xì)胞。LPS的測(cè)定方法比濁法（以橄欖油懸液為底物），以連續(xù)監(jiān)測(cè)法為常用。分光光度法：酶偶聯(lián)顯色比色法（多用1,2-甘油二酯為底物）采用人工合成底物1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸試靈酯設(shè)計(jì)的連續(xù)監(jiān)測(cè)法。此法為一步速率法，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)。LPS測(cè)定的臨床意義

主要用于診斷胰腺疾病，血清LPS在急性胰腺炎時(shí)活性升高的時(shí)間早，上升幅度大，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，故其診斷價(jià)值優(yōu)于AMY。在急性胰腺炎發(fā)作后2～12h，血清LPS可顯著升高，24h至峰值，48～72h可能恢復(fù)正常，但隨后又可持續(xù)升高8～15天。在酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝膽疾患等血清LPS也可有不同程度的升高。九、膽堿酯酶

生化特性

膽堿酯酶（ChE）是一類催化?；憠A水解的酶類。人體主要有兩種，即乙酰膽堿酯酶（AChE）又稱真性膽堿酯酶或膽堿酯酶Ⅰ、丁酰膽堿酯酶（BuChE）又稱假性膽堿酯酶或稱擬乙酰膽堿酯酶（PChE）或膽堿酯酶Ⅱ。臨床常規(guī)檢查的膽堿酯酶(SChE)即指后者，通常簡(jiǎn)稱為ChE。

組織分布

AChE主要分布于神經(jīng)組織、肌肉、紅細(xì)胞、肺等處，其生理功能是催化水解乙酰膽堿，能使神經(jīng)細(xì)胞反復(fù)去極化。ChE/BuChE主要在肝臟合成，也分布于胰臟、心臟、小腸黏膜、大腦灰質(zhì)、血漿及淋巴液等處。

ChE的測(cè)定方法

測(cè)定方法有兩類：以人工合成的底物測(cè)定膽堿衍生物的生成。丁酰硫代膽堿法是目前測(cè)定血清ChE最常用的方法。ChE測(cè)定的臨床意義

用于肝臟損傷和有機(jī)磷中毒的診斷。

有機(jī)磷中毒兩種ChE活性均減低：ChE活性在50％～70％為輕度30％～50％為中度30％以下為重度亞急性及慢性中毒，AcbE可降至O。

肝實(shí)質(zhì)損害肝實(shí)質(zhì)性損傷時(shí)，ChE合成降低；當(dāng)肝功能恢復(fù)后，ChE合成亦隨之逐漸轉(zhuǎn)為正常。

腎臟疾病(排泄障礙或合成亢進(jìn))；脂肪肝、甲亢、糖尿病等可出現(xiàn)ChE的增高。

代號(hào)中文名稱結(jié)果參考值單位TBil

總膽紅素262-20umol/LDBil直接膽紅素140-6umol/L

IBil

間接膽紅素24.72-19umol/lALT

谷丙轉(zhuǎn)氨酶43.60-42U/LTP

總蛋白6560-83g/LALB

白蛋白3835-55g/LGLB球蛋白2220-30g/LA/G

白球比1.721.5-2.5GGTY-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶7211-61U/LAST谷草轉(zhuǎn)氨酶320-37U/LALP堿性磷酸酶包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)報(bào)告單梗阻性黃疸酶學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目的選擇及應(yīng)用檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)用肝病有關(guān)酶ALT與AST肝細(xì)胞損害輕、中度損傷ALT升高為主，重度損傷以AST升高明顯。ALP與GGT膽汁淤滯，在膽汁排泄受阻的肝膽疾病時(shí)升高。骨疾病時(shí)升高。MAO肝臟纖維化，肝纖維化病變及肝硬化時(shí)可升高。ChE肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞功能，肝實(shí)質(zhì)損害致肝功能不全時(shí)，ChE減低。